Ghiglione, Yanina Gómez Castro, María Laura Sapienza , Carla Elisa Valan, Gonzalo

1. Translational and rotational settings of H2A.Znucleosomes across the Saccharomycescerevisiae genomeIstvan Albert, Travis N. Mavrich, Lynn P. Tomsho, Ji Qi, Sara J. Zanton, Stephan C. Schuster & B. Franklin Pugh Ghiglione, Yanina Gómez Castro, María Laura Sapienza, Carla Elisa Valan, Gonzalo

2. Introducción Nucleosoma formado por dímeros de histonas Alrededor del core de histonas:DNA (H2A, H2B, H3, H4) ¿Cómo es que la cromatina interfiere en la expresión génica? Todos los procesos que modifiquen las interacciones histona-DNA o histona-histona , ya sea dentro de un nucleosoma o entre nucleosomas van a afectar la expresión génica. Estos procesos son: 1)Posicionamiento de nucleosomas, 2) Modificación post-traduccional de histonas, 3) Cambio en la composición bioqca.de nucleosomas por reemplazo de histonas canónicas por histonas variantes.

3. Introducción Histonas del core: • Histonas Canónicas S! aumenta en fase S H2B, H2A, H3, H4 • Histonas Variantes S! a lo largo de todo el ciclo celular H3.3, H2AZ: Están asociadas a regiones transcripcionalmente activas. Posicionamiento Translacional o Rotacional: Los factores de transcripción tienen secuencias de reconocimiento específicas. Si dicha secuencia de reconocimiento se encuentra en la cara interna del DNA los factores no se pueden pegar Es importante conocer la organización del DNA en el nucleosoma: Por regla gral. el DNA se encuentra enrollado al azar, por lo que la misma secuencia puede tener distinto en enrollamiento en distintos núcleos.

4. Introducción • Posicionamiento Translacional: Phased: Los nucleosomas se encuentran siempre en el mismo lugar (posición+/- 5 ó 10 nucleótidos) dejando un linker accesible. Fuzzy: Los nucleosomas pueden encontrarse en promedio en cualquier posición posible. Hay dos posiciones translacionales: una relativamente fija, otra movible. • Posicionamiento Rotacional: Dos posiciones rotacionales posibles de acuerdo al enrrollamiento: • DNA inaccesible • DNA accesible

5. Introducción Los nucleosomas son el bloque fundamental de los cromosomas eucarióticos. El acceso a la información genética codificada en los cromosomas es dependiente de la posición de los nucleosomas a lo largo del DNA. Locaciones alternativas pueden tener profundos efectos en la expresión génica. En el trabajo secuenciaron el DNA de nucleosomas individuales de Saccharomyces cerevisiae H2A.Z Posicionamiento rotacional y translacional El posicionamiento translacional define un punto medio relativo del nucleosoma para un dado locus del DNA. El posicionamiento rotacional define la orientación de la hélice del DNA sobre la superficie de la histona. Entonces, los elementos regulatorios del DNA podrían residir en las regiones linker entre nucleosomas o a lo largo de la superficie del nucleosoma (donde podrían ser inaccesibles o accesibles)

6. Introducción Para entender cómo los genes están regulados por el posicionamiento de los nucleosomas Aislaron y secuenciaron la histona variante H2A.Z contenida en nucleosomas de S. cerevisiae (nucleosomas enriquecidos en regiones promotoras) Preguntas: • ¿Cuáles son las características del posicionamiento del DNA in vivo? • ¿Cuántos marcos translacionales y rotacionales ocupa el nucleosoma? • ¿Los elementos cromosomales poseen una arquitectura cromatínica específica? • ¿Cuál es la relación topológica entre la localización de los elementos promotores y los marcos rotacionales y translacionales de los nucleosomas?

7. Metodología:Preparación de nucleosomas H2A.Z Células incubadas en HCHO: Crosslink histonas al DNA 1) Colectadas por centrifugación 2) Buffer de lisis 3) Aislamiento de la cromatina nucleosomas H2A.Z 4) Tratamiento con Mnase (digestión de los linker de DNA) stop: hielo + EDTA 5) Inmunoprecipitación de la cromatina (ChiP) Sefarosa + Ig G lavado de la resina, se descarta el sn, resina resuspendida en buffer de elución TEV incubación 25ºC, ON eluído + proteinasa K para revertir el crosslink nucleosomas 6) DNA extraido con fenol.cloroformo y precipitado con EToH ChiP. DNA resuspendido en buffer TE, cargado en gel de agarosa y separado por electroforesis (UV) (Purificación del DNA) 7) Ligado de linker 8) Moléculas de captura emPCRPirosecuenciación BLAST

8. Metodología:Pirosecuenciación Técnica que se apoya en una reacción enzimática y que permite la secuenciación de DNA a gran escala en tiempos cortos DNA inmovilizado en soporte sólido S! de la cadena complementaria a partir de un primer agregando nucleótidos de a uno. 1)Si el nucleótido es el complementario, entonces se incorpora y al incorporarse se libera Ppi: • DNAn + dNTP polimerasa Ppi + DNAn+1 2) Ppi + APS sulfurilasa ATP + SO42- 3) ATP + luciferina + O2 luciferasa AMP + CO2 + oxiluciferina + Ppi + hv Entonces, por cada nucleótido incorporado se libera mayor señal luminosa y puedo conocer la secuencia cuantificando dicha señal

9. Metodología: • Preparación de la biblioteca a secuenciar 2) Inmovilización de cada simple cadena ( 1 cadena por bolita) 3) em-PCR (emulsión): En cada gotita se logra amplificar una simple cadena de DNA (ssDNA) 4) Se rompe la emulsión y se colocan las gotas en placa de pirosecuenciación. Se hacen fluir los dNTP (cada vez que se incorpora un nucleótido se libera luz) 5) Lectura de los datos

10. Resultados Partículas del core del nucleosoma (H2A.Z) inmunoprecipitadas ( MNasa ), DNA secuenciado individualmente en paralelo por pirosecuenciación Picos: se encuentran cerca del sitio de inicio de la transcripción de los genes (donde comienzan los promotores) Curva: dato suavizado (barras transformadas en curvas) Figura 1. Distribución del DNA nucleosomal H2A.Z en una región arbitraria del genoma de levadura. Cada barra vertical leída corresponde al número de secuencias leídas localizadas en una coordenada cromosomal individual. La ubicación de los ORFs es mostrada debajo de los picos. Nucleosomas H2A. Z están enriquecidos en zonas transcripcionalmente activas (zonas promotoras) y no a lo largo de la trayectoria del gen.

11. Resultados Tendencia de corte de la nucleasa • Corte de la Nucleasa Micrococcal no es aleatorio. • Sobre-digestión para minorizar tendencia.

12. Resultados Posicionamientos rotacionales y translacionales de los nucleosomas • Distribución de frecuencia de dinucleótidos AA, TT, AT y TA en contrafase con dinucleotidos GG, CC, GC y CG • Deficiencia en extremos de dinucleotidos de AT. (no debido a la especificidad de la Mnasa). Correspondiente a zona donde emerge cola de Histona 3

13. Resultados La distribución de la secuencia fue luego suavizada en dos niveles: fino y grueso, correspondiendo a los correspondiendo a las posiciones translacionales individuales y el promedio de los distintas posiciones respectivamente • Multiples picos equivalentes a deslocalización del nucleosoma. • Picos de hebra Watson y hebra Crick (lecturas independientes) coincidentes con respeto al control.

14. Resultados • Distancia pico-pico, para picos localizados en la misma cadena, usando los seis picos más altos. Distancia de 10 pb entre posiciones traslacionales • Dispersión de las frecuencias similar en las dos cadenas. • 10% de los nucleosomas es “muy difusos/borrosos” Mayoría con 3-4 posiciones traslacionales.

15. Resultados “Very fuzzy” Desvio estandar >25 REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN • TATA. • Regulación positiva SAGA, SW1/SNF y SWR-C. • Regulación negativa Hda1 (desacetilasa), Set1 (metilasa) y SSN6-TUP1 “Very wide” Nucleosoma con >20 pb entre pico en W y en C • Regulador de la cromatina SSN6-TUP1 PROTECCIÓN A MNASA

16. Resultados Figura 3. Distribución de nucleosomas H2A.Z en y alrededor de los elementos cromosomales. b) Esquema general del posicionamiento de los nucleosomas en y alrededor de los elementos cromosomales.

17. Resultados Figura 3. Distribución de nucleosomas H2A.Z en y alrededor de los elementos cromosomales. a) Número de nucleosomas localizados en función de la distancia del sitio de inicio ORF (panel izquierdo) o en función del sitio de inicio tRNA (panel derecho).

18. Resultados Figura 4. Distribución de los elementos regulatorios transcripcionales a lo largo de la superficie del nucleosoma. • Las TATA box se encuentran dispersas en la región “downstream” del primer nucleosoma río arriba de la región promotora (nucleosoma “distal” al ORF) • Los TSS se encuentran concentrados en el borde “upstream” del nucleosoma proximal al ORF

19. Resultados Surco mayor expuesto Figura 4. Distribución de los elementos regulatorios transcripcionales a lo largo de la superficie del nucleosoma. Sitios conservados para factores de transcripción que no son “ocupados”. Se ubican mayoritariamente hacia los bordes del ADN de la región nucleosomal. Sitios conservados para factores de trascripción que son “ocupados”. Se ubican hacia el centro del ADN de la región nucleosomal, mostrando una perioricidad de 10 pb dentro de la secuencia de DNA.

20. Resultados Figura 4. Distribución de los elementos regulatorios transcripcionales a lo largo de la superficie del nucleosoma. Diagrama de la ubicación de los distintos elementos de un promotor y la posición relativa de los nucleosomas distal (lejano al ORF) y proximal (cercano al ORF), basado en los datos recopilados en las figuras anteriores.

21. Conclusiones • Nucleosomas H2A. Z están enriquecidos en zonas transcripcionalmente activas (zonas promotoras) y no a lo largo de la trayectoria del gen • Distribución de frecuencia de dinucleótidos AA, TT, AT y TA en contrafase con dinucleotidos GG, CC, GC y CG. Fase de 10 pb. • Deficiencia en extremos de dinucleotidos de AT. Podría cumplir función regulatoria sobre la cola de H3 que emerge del nucleosoma en esa región. • Posicionamientos traslacionales, en cada hebra, distanciados principalmente en 10 pb. • Reposicionamiento de nucleosoma por reguladores de la cromatina puede tener importancia en regulación de la expresión génica como podría darse en el nucleosoma difuso (“very fuzzy”). • Pegado de reguladores de la cromatina pueden generar protección ante MNasa generando un nucleosoma en apariencia más ancho.

22. Conclusiones • Las cajas TATA se ubican dispersas en el borde downstream del nucleosoma distal, mientras que los TSS se ubican bien posicionados en la cara upstream del nucleosoma proximal. • Los sitios empleados por los factores de transcripción se concentran en las zonas adyacentes externas a los nucleosomas, mientras que las secuencias conservadas en desuso se ubican sobre los extremos del ADN nucleosomal