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BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA . MARCACION DE SONDAS PCR Y APLICACIONES: CONDICIONES DE LA REACCION PRIMERS DEGENERADOS RT – PCR REAL TIME PCR Dra. Liliana N. Guerra. Marcación de SONDAS.

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BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA

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  1. BIOLOGIA MOLECULAR EN MEDICINA • MARCACION DE SONDAS • PCR Y APLICACIONES: CONDICIONES DE LA REACCION PRIMERS DEGENERADOS RT – PCR REAL TIME PCR Dra. Liliana N. Guerra

  2. Marcación de SONDAS • LA PREPARACION DE LA SONDA ES CRITICA PARA LAS TECNICAS DE HIBRIDIZACION MOLECULAR EN LA HIBRIDIZACION: LA SONDA Y EL ACIDO NUCLEICO A HIBRIDIZAR DEBEN ESTAR COMO SIMPLE CADENA • SOUTHERN: SE TRATA EL GEL CON HCl PARA DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA • NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, SOLO MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SECUNDARIA

  3. Marcación de SONDAS TECNICAS MAS USADAS: • NICK – TRANSLATION • RANDOM PRIMER EXTENSION • OLIGONOCLEOTIDES PROBES SE USA UN NUCLEOTIDO MARCADO: • α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: GENERALMENTE d CTP • biotina-11-d UTP, dioxigenina-11-d UTP

  4. Marcación de SONDAS • LA SONDA PUEDE SER/ O NO RADIOACTIVA, EN TODOS LOS CASOS DEBE TENER ALTA ACTIVIDAD ESPECIFICA • DETERMINACION DE ACTIVIDAD ESPECIFICA: UNA VEZ MARCADO EL ADN SE PRECIPIA CON TCA 5% Y SE CUENTA LA MARCA PRECIPITADA • AE = TOTAL DE CUENTAS INCORPORADAS MASA DE ACIDO NUCLEICO USADO

  5. Marcación de SONDAS NICK TRANSLATION • ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y DNApolimerasa 1 • SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA • SE INTRODUCE NICK (AGUJERO) AL AZAR EN UNA DE LAS CADENAS DEL ADN • SE USA ENZIMA CON ACTIVIDAD 5’-3’ EXONUCLEASA: REMUEVE EL d NTP DEL EXTREMO 5’ (pol 1) Y EL NICK SE VA TRASLADANDO • SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA SEPHADEX

  6. Marcación de SONDAS

  7. Marcación de SONDAS RANDOM PRIMER • SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA O DE TIPO HEXANUCLEOTIDOS (CUALQUIERA CONSENSO) • SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA POR CALOR) • SE USA ENZIMA QUE NO POSEA ACTIVIDAD 5’ – 3’ EXONUCLEASA PARA QUE NO DEGRADE AL PRIMER (Klenow) • SE GENERA CADENA COMPLEMENTARIA • SE SEPARA EL MARCADO DEL RESTO POR PRECIPITACION CON ETANOL O COLUMNA SEPHADEX

  8. Marcación de SONDAS

  9. Marcación de SONDAS SONDA NO RADIOACTIVA: SE USA 1 ug DE MASA A MARCAR SENSIBILIDAD COMO RAD. CON AE = 1 x 10 8 dpm/ug

  10. Marcación de SONDAS MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS • SE UTILIZAN PARA REALIZAR SCREENING DE BIBLIOTECAS • SE MARCAN USANDO LA ENZIMA DEOXINUCLEOTIDO TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA d NTP AL EXTREMO 3’ • TEMPLADO DE 20 a 30 NT • MASA A MARCAR: 20 ng • ACTIVIDAD ESPECIFICA: 5 x 10 6 dpm/ ug • SE OBTIENE BAJA SEÑAL QUE AYUDA A NO TENER FONDO “SUCIO”

  11. Marcación de SONDAS

  12. Polymerase chain reaction (PCR) • Inventada en 1985 por Kary B. Mullis (Premio Nobel de Química, 1993) • Se usa en criminología/medicina forense (identificar personas a través de muestras de sangre, cabellos, por comparación de DNA) • En el área de evolución (obtener enormes cantidades de DNA a partir de fósiles que contienen trazas de DNA). • Revolucionó el diagnóstico de defectos genéticos, (mutaciones), la detección de virus (HIV, HCV). • Permite hacer millones de copias de una muestra ínfima de DNA.

  13. Polymerase chain reaction (PCR)

  14. Polymerase chain reaction (PCR)

  15. Polymerase chain reaction (PCR) Si repetimos este ciclo (desnaturalización, annealing, extensión) muchas veces logramos una amplificación exponencial

  16. Polymerase chain reaction (PCR)

  17. Polymerase chain reaction (PCR)

  18. Polymerase chain reaction (PCR) EL PRODUCTO FORMADO A PARTIR DE LA PCR SE PUEDE LLAMAR AMPLICON. ES ESPECIFICO Y SOLO DEBE VERSE UNA BANDA POR AMPLIFICACION CON PRIMERS ESPECIFICOS.

  19. Polymerase chain reaction (PCR) CONCEPTOS BASICOS: • ESPECIFICIDAD: GENERACION DE UN UNICO PRODUCTO DE AMPLIFICACION • EFICIENCIA: MAXIMA PRODUCCION DE AMPLIFICACION EN FUNCION DEL NUMERO DE CICLOS • FIDELIDAD: NUMERO DE ERRORES QUE COMETE LA DNA POLIMERASA DURANTE LA COPIA • SENSIBILIDAD: MINIMA CANTIDAD DE DNA QUE SE NECESITA PARA OBTENER UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS

  20. Polymerase chain reaction (PCR) VARIANTES DE PCR: • NESTED PCR: SE REALIZA UNA SEGUNDA REACCION DE PCR A PARTIR DEL AMPLICON, USANDO PRIMERS INTERNOS A LA 1ª AMPLIFICACION AUMENTA LA SENSIBILIDAD : SE REALIZAN 2 REACCIONES CONSECUTIVAS DE PCR AUMENTA LA ESPECIFICIDAD: SE UTILIZAN OTROS PRIMERS INTERNOS ESPECIFICOS • PCR MULTIPLEX: UNA REACCIÓN DE PCR CON VARIOS PARES DE PRIMERS QUE AMPLIFICAN DIFERENTES SECUENCIAS

  21. Polymerase chain reaction (PCR) • DNA polimerasas para PCR :Termoestables

  22. Polymerase chain reaction (PCR)

  23. Polymerase chain reaction (PCR)

  24. Polymerase chain reaction (PCR)

  25. Polymerase chain reaction (PCR)

  26. Polymerase chain reaction (PCR)

  27. Polymerase chain reaction (PCR) Cómo diseñamos los primers? Tº MELTING • MAYOR DE 20 nt: Tm = 8105 + 16.6 log M + 0.41 (G-C) – 500/ longitud • HASTA 20 nt: Tm = 4 ∑ ( G + C) + 2 ∑ (A + T)

  28. Polymerase chain reaction (PCR)

  29. Polymerase chain reaction (PCR)

  30. Polymerase chain reaction (PCR)

  31. Polymerase chain reaction (PCR)

  32. Polymerase chain reaction (PCR) RESUMEN • LONGITUD DE 18 a 24 d NTP • ESPECIFICOS • Tm = 55 a 75 C, CON Tm SIMILARES ENTRE SI • DISEÑAR PRIMERS CON CANTIDAD APROXIMADAMENTE 50% DE GC Y DISTRIBUCION AL AZAR • EVITAR PRIMERS CON SECUENCIAS DE POLIPURINAS Y/O POLIPIRIMIDINAS (Poly GC: DISMINUYE ESPECIFICIDAD - Poly AT: DISMINUYE EFICIENCIA) • EVITAR SECUENCIAS QUE FORMEN ESTRUCTURAS SECUNDARIAS • CONTROLAR QUE LOS PRIMERS NO HIBRIDICEN ENTRE SI • EVITAR MAS DE 3 CG SEGUIDAD EN EL EXTREMO 3´ • COMENZAR Y TERMINAR CON PURINAS • EXISTEN PROGRAMAS DNAstar PARA DISEÑO DE PRIMERS

  33. Polymerase chain reaction (PCR) PRIMERS DEGENERADOS: • SE USAN CUANDO QUIERO AMPLIFICAR UN GEN Y SOLO CONOZCO SU SECUENCIA DE AMINOACIDOS • SE REALIZAN TODOS LOS PRIMERS POSIBLES PARA UNIRLOS A LA SECUENCIA DE INTERES • NO LOS DISEÑAMOS EN NUESTRO LABORATORIO, SE PIDEN

  34. Polymerase chain reaction (PCR)

  35. Polymerase chain reaction (PCR) PRIMERS DEGENERADOS: • SE USAN SECUENCIAS QUE ESTEN CONSERVADAS PARA UNA FAMILIA DE PROTEINAS • SE USA SECUENCIA CON MENOR CANTIDAD DE CODONES POSIBLES • SE INCLUYEN SITIOS DE RESTRICCION PARA CLONAR POSTERIORMENTE

  36. Polymerase chain reaction (PCR)

  37. Polymerase chain reaction (PCR)

  38. Polymerase chain reaction (PCR)

  39. Polymerase chain reaction (PCR)

  40. Polymerase chain reaction (PCR)

  41. Polymerase chain reaction (PCR)

  42. Polymerase chain reaction (PCR)

  43. Polymerase chain reaction (PCR)

  44. Polymerase chain reaction (PCR)

  45. Polymerase chain reaction (PCR)

  46. Polymerase chain reaction (PCR)

  47. Polymerase chain reaction (PCR)

  48. Polymerase chain reaction (PCR)

  49. Polymerase chain reaction (PCR) CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD DISMINUIR: • Mg++ • [d NTP] • LARGO DE LOS CICLOS • NUMERO DE CICLOS • CONCENTRACION DE PRIMER AUMENTAR: • Tº DE ANNEALING

  50. Polymerase chain reaction (PCR) RESUMEN • MENOR TIEMPO Y MAYOR Tº DE ANNEALING: MAYOR ESPECIFICIDAD • CICLOS EXTRAS: MENOR ESPECIFICIDAD PARA OBTENER MAS MASA DE AMPLIFICACION SE REALIZA REAMPLIFICACION CONTROL NEGATIVO: • SIN ADN • MUESTRA CON ADN QUE NO CONTIENE SECUENCIA TARGET • SOLUCION DE EXTRACCION DE ADN

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