1 / 62

Isolace enzymů

Isolace enzymů. Proč isolovat enzymy?. Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou

akiko
Download Presentation

Isolace enzymů

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Isolace enzymů

  2. Proč isolovat enzymy? • Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu • Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou • Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů) • V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa ...)

  3. Zdroje enzymů • Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny • Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...) Selekce bakteriálních producentů amylas

  4. Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...) - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

  5. Živočišné zdroje • Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci • Jateční zvířata – orgány, krev • Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin ...; moč  urokinasa ...) • Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)

  6. Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

  7. Problémy se vzorkem • Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) • Malá množství cílového enzymu • Labilita enzymu

  8. Zásady pro práci s biologickým materiálem • Pokud možno zpracovat co nejdříve • V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC) • Rozmrazování – co nejrychleji • Nízká teplota při isolaci • Vhodné pH + iontová síla • Vhodná koncentrace bílkoviny • Zabránění pěnění • Omezení nežádoucí proteolytické aktivity • Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA ...)

  9. Cíl izolace • Získání homogenní bílkoviny • Zachování biologické aktivity Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného (optimálního) úsilí

  10. Distribuce enzymů • Intracelulární • V periplasmatickém prostoru • Extracelulární cytoplasma periplasma

  11. Membránově vázané bílkoviny

  12. Úprava biologického materiálu • Mletí (kulový mlýnek, masový strojek) • Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru) - Elvehjem-Potterův homogenizátor - třecí miska s pískem - výkonný mixer

  13. Dezintegrace mikrobiálních buněk • Narušení buněčné stěny • Způsoby – fyzikální - chemické - enzymové

  14. Fyzikální způsoby dezintegrace • Třecí miska + balotina, písek ... • Střídavé zmražování a roztávání • French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) • X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) • Ultrazvuk • Mlýnek se skleněnými balotinami X-press

  15. Chemické způsoby dezintegrace • Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu) • Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí) • Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) • Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

  16. Enzymové způsoby dezintegrace • Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

  17. Metody isolace enzymů • Srážení (precipitace) • Membránové separační procesy • Chromatografie • Elektroforéza

  18. Srážení • Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu • První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 • Filtrace nahrazena centrifugací

  19. Vysolování vsolování vysolování

  20. (NH4)2SO4 • Rozpustnost se málo mění s teplotou • Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) • Levný • Stabilizuje bílkoviny • Relativně čistý

  21. Srážení - dvojstupňově

  22. Provedení pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace úprava pH NH4OH El. míchačka

  23. Srážení organickými rozpouštědly • Kompletně mísitelné s vodou • Nereagují s bílkovinou • Musí mít dobrý precipitační efekt • Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! • Možné dvoustupňové srážení EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

  24. Srážení organickými polymery a sloučeninami Princip identický jako srážení s rozpouštědly • DEAE dextran • PEG • Polyakrylová kyselina • Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) • Kaprylová kyselina

  25. Srážení selektivní denaturací • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

  26. Tepelná denaturace • Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin • pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno • Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

  27. Membránové separační metody • Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul • Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku • Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

  28. Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

  29. Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza

  30. Chromatografické metody – základní rozdělení • Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze • Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie) • Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry • Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní • Nejčastěji sloupcová chromatografie • Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie

  31. Instrumentace pro LPC • Pumpa – peristaltická nebo gravitace • Gradient – mísič gradientu • Dávkování – přímo pumpou na kolonu • Kolony – skleněné • Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm • Vyhodnocování – zapisovač • Sběrač frakcí – programovatelný

  32. Částice sorbentu

  33. Chromatografické metody pro separaci proteinů • Gelová chromatografie • Ionexová chromatografie • Chromatografie s hydrofóbní interakcí • Afinitní chromatografie

  34. Gelová chromatografie • Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru • Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina • Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází • Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později • Isokratická eluce • Objem vzorku < 2 % objemu kolony • Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid • Možnost stanovení molekulových hmotností • Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

  35. Gelová permeační chromatografie

  36. Gelová permeační chromatografie Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

  37. Ionexová chromatografie • Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj • Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje • V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! • Celulosové a dextranové ionexy

  38. Ionexy • Katexy – záporný náboj vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- • Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

  39. Ionexová chromatografie proteinů • Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny • pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu • pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu • pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

  40. Ionexová chromatografie • Nanášení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – gradientová • Zvyšováním iontové síly • Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

  41. Typická ionexová chromatografie 1M Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient 0 Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

  42. Chromatografie s hydrofobní interakcí • Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl) • Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby) • Interakci podporuje vysoká iontová síla

  43. Hydrofobní chromatografie • Stacionární fáze – - C8,-fenyl • Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4) • Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

  44. Afinitní chromatografie - princip • Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) • Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce • Látka navázaná na nosič  afinitní ligand • Vazba ligandu přes raménko (spacer)

  45. Předpoklady pro vznik komplexu • Sterické – použití raménka (spacer) • Optimální pH, iontová síla

  46. Předpoklady pro vznik komplexu • Vazebné • Konformační

  47. Afinitní páry

  48. Interakce mezi DNA a endonukleasou

  49. Afinitní chromatografie 1. Analog substrátu Enzym Afinitní ligand + NosičRaménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + NosičRaménko Enzym vázaný na protilátku

  50. Provedení • Nanesení vzorku – nízká iontová síla • Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

More Related