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EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013. Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP.
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EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013
Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP 1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL; 2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV
Porcentagem de Descarte - HIV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) CMIA - Ag + Ac – ArchitectAbbott ( - 10%) Obs.: 2004 ELISA Ag + Ac 2011 NAT
Porcentagem de Descarte - HCV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) Obs.: 2008 ELISA Ag + Ac 2011 NAT
FPS 2010 ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV 1ndgen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22
“Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue” “Eu doo sangue para ter meus resultados” Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV 1ndgen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22
Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil • Port. 262 M.S. 02/2002 - introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado “pool” de 8 amostras • Port. 1407 M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios • Port. 79 01/2003 - adiada por 1 ano • Port. 112 01/2004 - Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV. Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.
Plataforma multiplex para HCV e HIV; Pool de 6 amostras; 2008 - estudos-piloto - SC 2010 - Estudos multicêntricos (outros hemocentros brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística. Registro em 12/2010 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE, RJ e SP 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA). Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos
blood units/day (based on the # of serology tests) 30 ¬ 100 100 ¬ 200 200 ¬ 400 400 ¬ 800 800 ¬ 1000 1000 ¬ 1500 1500 ¬ 2000 Belém, 349 Manaus, 376 Fortaleza, 646 Recife, 942 Salvador, 438 Brasília, 773 B.Horizonte, 1192 Campo Grande, 629 São Paulo 1923 • Rio de Janeiro, 1083 Curitiba, 769 Florianópolis, 1115 BUT … São Paulo State – due to size and complexity … will be addressed further ! • How to? • Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on: • Easiness for primary tube logisticsand report return within platelet saving time (<24h) • Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already established for serology tests.
Manual Operacional NAT • Sítio Testador (SIT) • 24 horas para resultado após o recebimento • Encaminhar tubo para coleta • Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos • Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia • Relatório para o SIT • Distribuição dos tubos para UCA • Coleta e centrifuga amostra • Conservar em geladeira • Unidade Coletora de Amostra (UCA) • Relatório para a URA • Coleta e centrifuga amostra • Conservar em geladeira
Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos Extração – 2h e 30min Pooling – 2h 30 min - 20ºC 30 min + 22ºC Amplificação–3h PCR Setup –30min Tempo total 9h
NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Tubo primário - PPT Pool – 6 amostras Plataforma automática Janus Perkin Elmer
NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Adição dapartícula calibradora Extração –Biorobô MDx (T. lise e protease, temp 65ºC) Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) –PCRtempo real Applied Biosystems 7300
Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca) - Processada dia 17 de março de 2011 • Amostra em SINGLE • Ct: 32,54
HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT
SOROCONVERSÃO - HIV gp120 envelope gp41 Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP Última Doação Negativa: 02/08/2011 Sexo: masculino Idade: 36 anos matriz transcriptase reversa RNA viral capsídeo Banda controle p17 p24 gp120 gp160 Teste de Western Blot: MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2 CCR5 CD4 CXCR4 Testes : Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia BioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”
Teste NAT - 17/04/2013 Pool de 6 amostras - CT: 34,6374
Teste NAT - 18/04/2013 Amostra única - CT: 32,8703
Teste NAT - 03/05/2013 Amostra única – CT: 17,856
Teste NAT - 17/05/2013 Amostra única – CT: 22,848
RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1:238.000 OBSERVADO = 1: 328.000
RENDIMENTO NAT NO BRASIL LEVI ET AL., HEMO 2011
RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500 RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:156.000
HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS. Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas. Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou soroconversão para HIV e NAT+.
HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS
HIV transfusion transmission despite NAT testingNanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Marcadoressorológicos e molecularesnainfecçãorecentepelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5hrs Anticorpos anti-HIV “blip” viremia 1ndgen 2nd gen Infecção Antígeno p24 3rd gen 11 16 22 InfectividadeteóricaDia 0RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia22