Secuencias de pulsos 1D Ahora tenemos muchas de las herramientas necesarias para

1. Secuencias de pulsos 1D • Ahora tenemos muchas de las herramientas necesarias para • analizar secuencias de pulsos. La mas simple, la secuencia • usada para obtener un espectro 1D comun, nos sirve para • hacer algunas definiciones de notacion: • Vectores: • Diagrama: • Dependiendo de la direccion del pulso, usamos 90x or 90y (o • 90f si queremos otras fases) para indicar la direccion relativa • del campo B1 con respeco a Mo en el sistema rotatorio. • El periodo de adquisicion siempre se representa como una • FID para el nucleo en observacion (el triangulo naranja). z z Mo 90y x x pulso Mxy y y adquisicion 90y 90y n

2. ‘Inversion recovery’ - Medida de T1 • Medir T1 es importante, ya que la relajacion de distintos • nucleos en una molecula nos da informacion acerca de la • mobilidad local. No se puede medir directamente de la FID • porque el T1 afecta magnetizacion que no detectamos. • Usamos la secuencia de pulsos siguiente: • Si analizamos despues del pulso p: • Como estamos dejando que la señal decaiga por tiempos • distintos solo bajo el efecto de relajacion longitudinal (T1), • vamos a ver como distintos tD’s afectan a la intensidad de la • FID, y por ende a la intensidad de la señal despues de la TF. 180y (o x) 90y tD z z 180y (o x) x x tD y y

3. ‘Inversion recovery’ (continuado) • Segun al intervalo tD que usemos veremos señales cuya • intensidad varia dependiendo del tiempo de relajacion T1 del • nucleo (pico) que estemos mirando. tD = 0 z z x 90y x TF y y tD > 0 z z x 90y x TF y y tD >> 0 z z x 90y x TF y y

4. intensidad ( ) • Es una exponencial con constante de decaimiento igual a • T1. Tambien sirve para eliminar señales dependiendo de • su T1 (agua…). ‘Inversion recovery’ (…) a 40oC • Graficando intensidad contra tiempo • nos da la siguiente curva: I(t) = I * ( 1 - 2 * e - t / T1 ) tiempo

5. Ecos de espin • En principio, para medir T2 solo tenemos que calcular la • envoltura de la FID (o el ancho de pico), ya que la señal en • Mxy, en teoria, dacae solo debido a la relajacion transversal. • El problema es que el decaimiento que vemos en Mxy no se • debe solo a relajacion, pero tambien a inhomogeneidades • de Bo (el defasado de la señal). La constante de decaimiento • que vemos en la FID se llama T2*. Para medir T2 • correctamente usamos ecos de espin. • La secuencia de pulsos es la siguiente: • Los ecos de espin deben ser de las primeras secuencias de • pulsos inventadas, aun antes de que existiera la TF. A pesar • de lo simple que son, los ecos de espin se usan como un • bloque en secuencias de pulsos mas complejas para • reenfocar Mxy. 90y 180y (o x) tD tD

6. Ecos de espin • Hacemos el analisis despues del pulso de 90y: • Ahora volvemos a coordenadas <xyz>: z y y tD x  x x y desfasado y y tD x x 180y (o x) reenfoque z y  x y

7. intensidad ( ) • Ecos de espin (continuado) • Si adquirimos la FID justito despues del eco, la intensidad • de la señal despues de la TF esta afectada solo por relajacion • T2 y no por desfasaje debido a un mal Bo. Repetimos para • diferentes tD’s y graficamos intensidaad contra 2 *tD. En este • caso es un decaimiento simple, y de alli obtenemos T2. a 90oC I(t) = Io * e - t / T2 tiempo

8. Aplicaciones de secuencias de eco de espin • Hasta ahora no dijimos como se comportan los corrimientos • quimicos y los acoples en los ecos de espin. Aca es que • se empieza a ver lo importante que son. • Una de las cosas mas molestas (a veces) de los espectros • es ‘corregir la fase.’ ¿Porque aparece la fase? Hay que • pensar en los efectos del corrimiento quimico en distintas • componentes de Mxy en un periodo de tiempo corto. • Este periodo, que es llamado el ‘acquisition delay’ (DE), • lo necesitamos porque sino los ‘restos’ del pulso de alta • potencia nos dan un monton de artefactos en el espectro. • Lo que sucede debido a esto es que todos los espines tienen • oportunidad de evolucionar bajo los efectos de corrimiento • quimico, y por lo tanto cuando prendemos el detector todos • van a estar a estar a cierta fase con respecto a la portadora. • Va a ser una mezcla de señales absortivas/dispersivas… y y ...  x x

9. La fase del espectro • Osea, la fase de las lineas va a ser una combinacion de • señales absorptivas o reales (cosenos) y dispersivas o • imaginarias (senos) en la FID. Dependiendo de la frecuencia • de las lineas, tendremos mas o menos componentes • seno o coseno: • S(w)x = S cosenos(w) - espectro real • S(w)y = S senos(w) - espectro imaginario • Lo que queremos es un espectro absortivo puro, y lo que • podemos hacer es combinar distintas proporciones de la • señal real con la imaginaria obtenidas por el detector. La • combinacion va a depender de la frecuencia del espectro: • S(w) = S(w)x + [ fo + f1(w) ] * S(w)y • A fose le llama la fase de orden cero, y a f1la fase de • primer orden. La correccion se hace generalmente a mano. • En algunos casos (nucleos con bajo g) es imposible… • Hay un experimento con ecos de espin que teoricamente • nos deja eliminar estos efectos. Despues veremos que en • realidad no sirve para mucho...

10. Ecos de espin y corrimientos quimicos • De vuelta a los ecos de espin. Despues del pulso de p / 2, los • efectos sobre elementos de Mxy con un offset respecto a la • frecuencia de B1 son similares a los que se ven para para • una señal que se desfasa por inhomogeneidad de campo: • Despues de un tiempo tD, la magnetizacion precesiona en el • plano <xy> por weff * tD radianes (f), donde weff =w-wo. • Luego del puslo py el segundo tD, Mxy precesiona la misma • cantidad pero volviendo al eje x. • Aparte de estar patas para arriba, no hay desfasaje de la • señal si adquirimos la FID justito despues del segundo tD. En • principio, esta secuencia nos da espectros absortivos puros… z y y tD x  x x f y weff y y 180 tD x  x f weff

11. Ecos de espin y acople heteronuclear • A cosas mas interesantes/utiles. Vamos a considerar un 13C • acoplado a un 1H: • Si miramos el espectro 13C vemos un doblete ya que hay • acople con 1H. Los 1JCH’s son de 50 a 250 Hz, complican el • espectro, y vemos señales superpuestas. Generalmente • desacoplamos 1H, lo que significa que saturamos las • transiciones de 1H. Las señales de 13C ahora son singuletes: J (Hz) bCbH 13C aCbH 1H 1H bCaH I 13C aCaH bCbH 13C aCbH 1H 1H bCaH 13C I aCaH

12. Ecos de espin y acople heteronuclear (…) • Modificamos el eco de espin para incluir desacople: • Ahora analizamos lo que esta secuencia de puslos hace • con magnetizacion de 13C en distintos casos. Primero • consideramos un CH. Despues del pulso p / 2, Mxy • evoluciona bajo el efecto de acople J. Se dice que cada • vector esta marcado por los estados de espin del 1H con el • cual esta acoplado, a y b: • Acordarse que bajo acople J tenemos f= p * tD * J. 90y 180y (o x) tD tD 13C: {1H} 1H: z y y - J / 2 (a) tD  x x x f y (b) J / 2

13. Ecos de espin y acople heteronuclear (…) • Ahora aplicamos el puslo p, que invierte la magnetizacion, y • empezamos a desacoplar 1H. Esto remueve las marcas de • los dos vectores, y en practica los ‘frena.’ Se colapsan en • en uno, y las componentes con signo opuesto se cancelan: • En este caso el segundo tD durante el desacople de 1H esta • para reenfocar el corrimiento quimico y obtener buena fase… • Vemos que la señal va a variar en intensidad segun tD. • Ahora, si tomamos espectros para distintos valores tD’s y • graficamos la intensidad obtenemos algo asi para el CH: y y y   x x x tD= 1 / 2J tD= 1 / J tD

14. Ecos de espin y acople heteronuclear (…) • La intensidad de la señal varia con el coseno de tD, es cero • para valores de tD multiplos de 1 / 2J, y maxima en multiplos • de 1 / J. • Si consideramos un CH2, el analisis es similar, y obtenemos • la siguiente grafica de amplitudes contra tD: • De forma similar, para un CH3 tenemos: tD= 1 / 2J tD tD= 1 / J tD= 1 / 2J tD= 1 / J tD

15. O H H O • Ecos de espin y acople heteronuclear (…) • Ahora, si asumimos que todos los acoples 1JCH son mas o • menos iguales (verdad hasta cierto punto), y usamos • la secuencia de pulsos en la siguiente molecula con un tD • igual a 1 / J, obtenemos: • El experimento puede discriminar entre C, CH, CH2, y CH3, • e identificamos todos los tipos de carbono en la molecula. • La secuencia se llama test de protones enlazados (o • attached proton test, APT). Es de las primeras secuencias • de pulosos usadas por ‘quimicos’ en general. Remplazada • por la secuencias INEPTyDEPT que veremos mas adelante. 5 3 7 2 4 6 6 1 1,4 150 100 50 0 ppm 5 2,3 7

16. Ecos de espin y acople homonuclear • Aca veremos por que los ecos de espin no sirven para • obtener un espectro de fase pura. El problema es que solo • consideramos sistemas con espines no acoplados • (singuletes) o sistemas con acople heteronuclear. • Consideremos un 1H acoplado a otro 1H, y que estamos • exactamente en resonancia. Despues del pulso p / 2 de la • secuencia de eco de espin, y el periodo tD tenemos evolucion • bajo los efectos del acople J. Cada vector va a estar marcado • por el estado del otro 1H con el que esta acoplado: • El problema ahora es que el pulso p inverte las poblaciones • de todos los protones de la muestra. Por lo tanto, invertimos • las marcas del proton en consideracion. z J / 2 y y (a) tD  x x x y (b) J / 2

17. Ecos de espin y acople homonuclear (…) • El pulso p invierte los vectores y las marcas: • En vez de reenfocar, los vectores se mueven en reversa, • y tenemos mas separacion de las lineas del multiplete • durante el segundo periodo de evolucion. Si tomamos una • FID, la señal va a ser completamente dispersiva (a pesar de • que esto depende del largo de los periodos tD): J / 2 J / 2 y y (a) (b) 180y (or x) x x (b) (a) J / 2 J / 2 y tD FID, TF x

18. Ecos de espin y acople homonuclear (…) • Ahora vemos porque no es tan util. Para diferentes valores • de tD obtenemos las siguientes señales para un doblete • acoplado con un triplete (los dos tienen la misma J…): • A pesar de que no es muy util en un espectro de 1H 1D, • entender como funciona es crucial para entender la espec- • troscopia 2DJ. El fenomeno se conoce como modulacion J.

19. 90y 90-y tD • Pulsos binomiales • Los pulsos binomiales son un ejemplo simple de trenes de • pulsos que se pueden explicar con vectores. Su uso mas • tipico es para la eliminacion de picos de solvente (ver T1…). • El mas simple es el pulso binomial 1:1, dos pulsos de p / 2 • en direccion opuesta, separados por cierto intervalo td, y • exactamente en resonancia con el pico a eliminar: • El primer p / 2 en y pone todo en <xy>. Despues de td, las • señales se mueven para un lado u otro de x. Todas, menos • la señal que nos interesa eliminar del espectro: z z y Mo 90y tD x x x y y

20. Pulsos binomiales (continuado) • El segundo pulso p / 2 en -y hace que todo lo que este en x • vuelva al eje z. Esto incluye toda la señal correspondiente al • pico a eliminar, y las componentes x de las otra señales: • La FID resultante solo tiene señales que corresponden a • picos que no estan en resonancia con la portadora. Todos • estan en fase con el receptor, pero picos a cada lado de la • portadora tienen signo opuesto: • Debido al td, no solo los picos en resonancia se anulan, sino • que todas las señales que esten a multiplos de 1 / (2*td) Hz • (una señal con esa frecuencia da 0.5 vueltas en td…). y y 90-y  x x x y y FID (y) TF x

21. Pulsos binomiales (…) • Como dije, se usan para eliminar el pico de agua, sobretodo • en casos que otras secuencias perturben protones que • intercambian con agua (NHs, OHs, etc.). ~ 50 mM de azucar • en H2O/D2O (9 a 1). • Espectro 1H: • Espectro 1H con pulso 1:1 (td = 200 S):

22. 1/8 90y 3/8 90-y 3/8 90y 1/8 90-y tD tD tD • Pulsos binomiales (…) • Para evitar el cambio de signo hay otros trenes binomiales, • como por ejemplo el 1:3:3:1: • Igual dan artefactos. Ninguno de estos trenes de pulsos, o • experimentos que se valen de diferencias de T1, dan • resultados tan buenos como secuencias con gradientes, • como por ejemplo el WEFT o WATERGATE. • Para la misma muestra, esto es el 1H con WEFT: