1 / 16

Izolace NA z biologického materiálu

Izolace NA z biologického materiálu. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU. Zdroje NA. Materiál získaný ex vivo - biopsie Archivní materiál - FFPE. Uchování a transport biol. materiálu. Je dán účelem odběru a technikou a místem provedení odběru.

ama
Download Presentation

Izolace NA z biologického materiálu

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Izolace NA z biologického materiálu MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  2. Zdroje NA • Materiál získaný ex vivo - biopsie • Archivní materiál - FFPE

  3. Uchování a transport biol. materiálu • Je dán účelem odběru a technikou a místem provedení odběru. • Obecně se snažíme materiál co nejdříve zpracovat do podoby, kdy co nejméně podléhat degradaci

  4. Charakter zpracovávaných tkání • Buněčnost – determinuje množství NA • Přítomnost lipidů – může interferovat s izolačními postupy • Charakter extracelulární matrix – rozhoduje o možnostech homogenizace tkáně • Přítomnost inhibitorů PCR – heparin, některé metabolity v rostlinných bb.

  5. Homogenizace tkání • Homogenizátory, desintegrátory • Disruption x homogenization

  6. Účel homogenizace a disrupce • Disrupce – rozbití buněčných stěn, plazmatické membrány a organel. • Homogenizace – snižuje viskozitu vzorku „trháním“ velkých molekul. (důležité při izolaci RNA).

  7. Typy homogenizátorů • „Stříkačka jehly“ • Rotor-stator homogenizátor • Kolonky

  8. Mixer Mill • Mlýn používající wolframové kuličky

  9. Izolace nukleových kyselin • Extrakce a precipitace • Adsorpční metody • Kolonky • kuličky

  10. Přístupy k izolaci DNA buňka DNA RNA proteiny Lýza biomembrán A. Odstraňujeme lipidy extrakcí chloro-formem, bílkoviny srážením fenolem B. Za určitých podmínek absorbujeme DNA na povrch SiO2, ostatní odsajeme Nukleové kyseli-ny zůstávají v roztoku, bílkovi-ny se sráží a se-dimentují odstře-děním na rozhra-ní, lipidy jsou ex-trahovány do chloroformu SiO2 je obvykle v podobě skleně-ných částic, které jsou těžké, snad-no sedimentují, ostatní lze odsát. vodný roztok (DNA, RNA) Rozhraní (bílkoviny) Změnou podmínek dojde opět k uvolnění DNA do čistého roztoku chloroform(lipidy) RNA je příp. odstraněna RNázou

  11. Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění

  12. Izolační kolonky

  13. Odstranění RNA-áz • DEPC diethyl pyrocarbonate • Karcinogen • Deaktivovatelný při 100 st.C http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

  14. Izolace RNA 28S 18S

  15. Spektrofotometrické stanovení • Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica) • A260 – absorbance vlastní NA • A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA) • A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin) • A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

  16. Spektrofotometry • Kyvetové, bezkyvetové

More Related