Podsumowanie - wykład 2

1. Podsumowanie - wykład 2 • Struktura kwasów nukleinowych ( DNA i RNA) • Dwuniciowa helisa DNA ( typy helis DNA) • Rodzaje i funkcje RNA (podział funkcyjny; wielkość cząsteczek) • Właściwości kwasów nukleinowych • - stabilność, wpływ niskiego i wysokiego pH, denaturacja chemiczna, denaturacja termiczna, gęstość) • 5. Metody izolacji kwasów nukleinowych (założenia i etapy) • 6. CTAB dla DNA, TRIZOL (TRI) dla RNA; zestawy komercyjne • 7. Ocena stopnia czystości i ilości preparatów DNA i RNA • Pomiary spektrofotometryczne • Elektroforeza w żelu agarozowym;

2. TYPY HELIS DNA Forma B - DNA – prawoskrętna, zidentyfikowana przez Watsona i Cricka występuje in vivo w każdym DNA; Forma A - DNA – prawoskrętna, powstaje w warunkach niskiej wilgotności, jej struktura jest szersza i krótsza niż formy B in vivo hybrydach DNA-RNA Dwuniciowe helisy A, B, Z Forma Z - DNA – lewoskrętna, powstaje w dwuniciowym DNA, w którym zasady pirymidynowe i purynowe występują po sobie na przemian np. CGCGCG; w normalnym DNA tworzy się b. rzadko. A B Z

3. IZOLACJA CAŁkowitegoDNA Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu; Izolacja z wysoleniem białek Izolacja poprzez związanie znośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA ( zestawy komercyjne – izolacja DNA na kolumienkach)

4. ETAPY IZOLACJI DNA • Fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowejmateriału biologicznego, tzw. homogenizacja. • Uwolnienie DNA - DNA chroniony jest w komórce w różnych błonowych strukturach subkomórkowych, takich jak np.: jądro, mitochondria. W celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty. • Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych. • Oddzielenie DNA (wytrącanie) od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, (detergentów, soli). • Przygotowanie DNA do przechowywania.

5. IZOLACJA CAŁKOWITEGO RNA Metoda izolacji wg Chomczyńskiego i Sacchi (1987) ZASADA: Izotiocyjanian guanidyny należy do substancji najefektywniej denaturujących białka. Jest on także silnym inhibitorem rybonukleaz. Metoda ta opiera się na ekstrakcji izotiocyjaninem guanidyny i mieszaniną fenol/chloroform w środowisku kwasowym.

6. Czystość preparatów DNA i RNA Czystość preparatów DNA i RNA można określić obliczając stosunek: A260/A280nm; Czysty DNA ma A260/A280 nm= 1.8; czysty RNA = 2.0; Wartość A260/A280 = 1.5 oznacza zanieczyszczenie białkiem w około 50 %.

7. Elektroforeza w żelu agarozowym Polisacharyd oczyszczany z glonów morskich (krasnorostów); Agaroza Właściwości agarozy / żelu agarozowego: -transparentność –dobrze widoczne rozdzielane fragmenty - brak obecności DNaz /RNaz - niski punkt topnienia - wysoka wytrzymałość żelu - wysoka rozdzielczość produktów PCR oraz fragmentów DNA w zakresie 100 -10 000 pz( szeroki zakres stężeń) - bardzo niskie tło fluorescencji przy barwieniu bromkiem etydyny