Esterilização

1. Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTecGraduação em BiotecnologiaDisciplina de BIOPROCESSOSProfa. Dra. Patrícia S. Diaz Esterilização

2. Em um processo fermentativo são três os pontos de esterilização necessários: Equipamento Mosto Ar

3. Esterilização do Equipamento

4. Esterilização do Equipamento Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfície. Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eliminação parcial da população microbiana dos equipamentos é suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Exemplo: processos onde inibidores de crescimento são produzidos e o teor do inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microrganismos. Inibidores de crescimento: fermentação alcoólica, produção de vinagre / ácido acético, ácido lático, antibióticos, biocidas, etc. Na indústria de laticínios, o processo de pasteurização destrói a maior parte, mas não todos os microrganismos. Assim, desenvolveram-se processos de desinfecção que não esterilizam, mas garantem a assepsia adequada. Exemplo: indústria de alimentos – a eliminação patógenos é realiza por processos não esterilizantes.

5. A esterilização dos equipamentos é realizada por: • Métodos físicos: calor seco, calor úmido, radiação ultravioleta, radiação com partículas ionizantes (gama) e ultra-som; • 2) Métodos químicos: limpeza do equipamento com líquidos ou gases que matam ou danificam irreversivelmente sua capacidade reprodutiva – hipoclorito, fenóis, formaldeído, óxido de etileno, ozônio, dióxido de enxofre, etc. • Reatores bioquímicos e tubulações são, geralmente, esterilizados pela aplicação de calor úmido (vapor saturado). • Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação (bomba, filtros, centrífugas, misturadores, separadores, colunas cromatográficas, homogeneizadores, etc.) são esterilizados preferencialmente por calor úmido. • Material de laboratório utilizado no processo é esterilizado por vapor úmido (autoclave), seco (fornos) e por radiação ultravioleta. • Embalagens são em geral esterilizadas por radiação gama, calor úmido ou por lavagem com produtos químicos apropriados.

6. Tabela - Principais termos técnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados

7. Modo de ação dos agentes esterilizantes Os agentes esterilizantes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formação de substâncias químicas letais no interior das células e/ou alterações em moléculas essenciais para a manutenção e sobrevivência celular, levando à morte do microrganismo. A morte celular pode ser causada por uma ou mais lesões. Na célula viva normal existem inúmeros alvos possíveis de lesão celular, tais como: Enzimas, responsáveis pelos processos metabólicos; Membrana citoplasmática, que mantém a integridade do conteúdo celular, controlando o transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo, além de ser também o local de algumas reações enzimáticas; Parede celular, que proporciona rigidez e resistência mecânica aos microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos Dano genético, responsável pela codificação de alguma enzima essencial. Uma lesão em qualquer um desses níveis pode desencadear alterações que levam a morte do microrganismo.

8. 1 - Esterilização por Agentes Físicos Os principais agentes físicos esterilizantes são: calor seco, calor úmido, radiação ultravioleta e radiação gama. Cada um deles encontra aplicação em diferentes partes do processo de assepsia. 1.1 - Esterilização por calor úmido O agente de uso mais freqüente é o calor úmido, fornecido por vapor de água saturado. O calor é obtido em caldeiras e distribuído por dutos de aço galvanizado ou inoxidável, isolados termicamente. Pelas altas temperaturas e pressões na caldeira o vapor é considerado estéril. 1.1.1 – Esterilização de reatores vazios Consiste em injetar vapor diretamente no seu interior e promover a expulsão do ar presente. Após a saída do ar, o reator é fechado e injeta-se vapor até que a temperatura e pressão internas sejam adequadas, normalmente 121°C e 1 atm. Novas injeções de vapor são realizadas para manter o processo de esterilização. Terminada a esterilização, a entrada de vapor é fechada e a entrada de ar estéril aberta para que durante o resfriamento não se crie vácuo, o que poderia gerar danos no equipamento ou promover a entrada de ar externo contaminado.

9. 1.1.2 – Esterilização de reatores com meio de cultura – esterilização descontínua É realizada em três etapas. Durante o processo uma agitação mínima deve ser mantida. Primeira etapa - Inicialmente circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a temperatura seja maior que 96 a 97°C. Durante essa etapa a cabeça do tanque deve receber vapor fluente para expulsão do ar do seu interior. Ao mesmo tempo, as válvulas, filtros e tubulações de entrada e saída do reator também são esterilizadas por vapor fluente. Esta etapa é crítica devido ao tempo necessário para o aquecimento do meio de cultura, da temperatura ambiente até 97°C. Uma relação adequada entre a área da serpentina ou camisa e o meio de cultura favorece o rápido aquecimento. Dois exemplos são mostrados abaixo:

10. Curvas de aquecimento de reatores de 200 L e de 2000 L

11. Segunda etapa – injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até que atinja 100°C. A partir desse momento, o reator é completamente fechado e a injeção de vapor continua até que a temperatura e pressão internas sejam adequadas (121°C e 1 atm). • OBS: A injeção direta de vapor aumenta em 10 a 15% o volume do meio de cultura. Por isso, deve ser preparado concentrado. • Terceira etapa – Atingidas as condições de esterilização, a injeção direta de vapor pode ser cortada e o controle da temperatura e pressão mantidos através da serpentina ou camisa pelo tempo necessário. • Resfriamento:é realizado pela circulação de água fria na serpentina ou camisa. Quando a temperatura atingir 100°C, deve-se injetar ar no tanque para evitar formação de vácuo pela condensação do vapor. • Tempo de esterilização • O tempo de esterilização é função das condições do próprio reator e do processo. • Se um reator é usado sempre com o mesmo microrganismo, e se estiver limpo, sem fissuras, sem vazamentos, 20 a 40 min a 121°C e 1 atm devem ser suficientes para esterilização. • Se for um reator multipropósito utilizado com bactérias ou fungos formadores de esporos, deve passar por assepsia química e após, esterilização a 121°C e 1 atm por um tempo que pode ser superior a 60 min.

12. Modelos de biorreatores com serpentina, jaqueta e camisa para o sistema de aquecimento / resfriamento Serpentina interna Camisa Jaqueta Serpentina interna Serpentina interna

13. Figura - Corte transversal de um acetificador para elaboração de vinagre pelo método com fermentação acética submersa; a- turbina de ar; b- compensador de ar; c- dispositivo para coletar líquido de condensação; d-e- dispositivo para controlar a formação de espuma; f- dispositivo para medir o álcool; g- serpentina para refrigeração; h- dispositivo para refrigeração; i- termômetro; j- bomba para entrada do vinho; k- bomba para retirada do vinagre.

14. 1.1.3 – Reatores com esterilização programável Equipamentos mais sofisticados, completamente automatizados, tem a função de esterilização incorporada em seu software de controle. Em geral, pode-se escolher o tempo e a temperatura de esterilização. A auto-esterilização pode ser realizada com injeção de vapor, do mesmo modo como descrito anteriormente. A injeção direta de vapor pode, em alguns casos, provocar a formação de espuma em grande quantidade. Se o problema for crítico, a esterilização deve ser realizada através da camisa ou serpentina. 1.1.4 – Esterilização em autoclaves Utilizada para reatores de pequeno porte (até 30 L), vidrarias e outros materiais, incluindo meio de cultura. As autoclaves apresentam modelos verticais e horizontais. O aquecimento da água para geração de vapor pode ser elétrico ou a gás. Ainda pode ser gerado por uma caldeira externa e enviado para a autoclave.

15. Modo de operação de uma autoclave A operação é simples. Se o vapor é gerado internamente, a água deve ser completada até a marca indicada pelo fabricante. O material deve ser colocado dentro da autoclave e esta deve ser fechada. O vapor gerado ocupa toda a área interna e deve ser enviado para fora por uma válvula de descarga, expulsando todo o ar contido dentro da autoclave e dentro dos frascos e equipamentos. Após a saída do ar, a válvula é fechada e a temperatura e pressão começam a aumentar até atingir a pressão e T de esterilização (121°C e 1 atm). O sistema de aquecimento deve ser controlado para manter a pressão e temperatura constantes durante o período de esterilização, o qual varia de 20 a 40 min. A etapa de resfriamento é iniciada com o desligamento do aquecimento ou interrupção do fornecimento de vapor. A autoclave só deve ser aberta após a temperatura chegar a T ambiente, já que uma despressurização brusca pode provocar danos nos sensores dos equipamentos como sondas de pH e oxigênio dissolvido.

18. Modo de ação do agente esterilizante: calor úmido A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um dos métodos mais efetivos para destruição de microrganismos. O calor úmido mata os microrganismos principalmente pela desnaturação irreversível de suas proteínas, destruindo enzimas e membranas celulares. A resistência das proteínas ao calor é uma função da hidratação da células. Quanto maior a quantidade de água, mais facilmente entrará nos domínios internos das moléculas de proteína, causando mudanças conformacionais irreversíveis. Os carboidratos também sofrem alterações, sendo caramelizados e gerando produtos tóxicos. Turvo Translúcido Dois frascos com meio de cultura: (a) esterilizado após 24 horas de preparo e, (b) esterilizado imediatamente após o preparo. (a) (b)

19. 1.2 - Esterilização por calor seco A esterilização por calor seco é empregada para vidrarias, metais e sólidos resistentes ao calor. É realizada em fornos ou estufas que atinjam temperaturas superiores a 150 °C. Na ausência de umidade, a transferência de calor é mais lenta e os microrganismos apresentam maior resistência a inativação. Dessa forma, os tempos de exposição ao calor são superiores (cerca de 3 a 4 horas). Modo de ação do agente esterilizante: calor seco O calor seco destrói os microrganismos através da oxidação de seus constituintes químicos. Entretanto, dependendo do conteúdo de água dentro da célula pode ocorrer a coagulação de proteínas. A esterilização pelo calor seco é muito mais lenta e menos eficaz que por calor úmido. 170 °C por 2 horas Incineração

20. 1.3 - Esterilização por radiação ultravioleta É utilizada para esterilizar materiais sólidos como vidrarias, utensílios metálicos, embalagens, etc. Ultravioleta jamais deve ser utilizado na presença de pessoas ou animais. A fonte de ultravioleta é normalmente um lâmpada emissora dessa radiação. A esterilização é realizada simplesmente expondo o material a radiação em ambiente fechado, pelo tempo adequado. Como a capacidade de penetração da radiação é muito baixa, apenas a superfície do material exposto e o ar ao redor são esterilizados. Modo de ação do agente esterilizante: radiação ultravioleta Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a estrutura dessas moléculas e provocando danos ao processo de manutenção e divisão celular. Em função do tempo de exposição, esses danos normalmente levam os microrganismos a morte.

21. 1.3 - Esterilização por radiação gama Radiação gama, em geral produzida por cobalto 60 ou césio 137, tem poder de penetração extremamente alto. Os materiais expostos a radiação gama não guardam resquícios radioativos, daí ser um método seguro de esterilização. O bombardeio deve ser realizado em câmaras especiais muito grandes. Uma vez colocadas em operação, não é mais possível impedir a emissão da radiação, de forma que essas câmaras operam continuamente. A esterilização é feita colocando-se o material em um contêiner, o qual é colocado sobre uma esteira que circula no interior da câmara de irradiação. O material pode entrar e sair da câmara várias vezes até atingir o nível de irradiação adequado. Dada a complexidade do método, apenas materiais como vidrarias, metais e materiais sólidos (pós, alimentos, sementes, embalagens, etc.) são submetidos a esse processo. A unidade de medida da irradiação no SI é o gray. Materiais pouco contaminados são submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Matarias mais contaminados utilizam doses de 50 a 75 quilograys. O microrganismos mais resistente chama-se Deinococcusradiodurans e exige cerca de 60 quilograys para ser inativado. 1 gray 100 rad.

22. Centro de desenvolvimento da energia nuclear – UFMG – Belo Horizonte - Laboratório de radiação gama Sala de Operação do Laboratório de Irradiação Gama Interior da câmara de irradiação: mesas giratórias para posicionamento dos produtos a serem irradiados e protetor da fonte de Cobalto 60 Irradiação de Livros e papel para conservação e desinfestação. Café tratado por processo de irradiação visando desinfestação Frutas e legumes tratados por processo de irradiação Esterilização de Produtos Médico Farmacêutico

23. Modo de ação do agente esterilizante: radiação ionizante As radiações ionizantes eletromagnéticas são principalmente alfa (α), beta (β), gama (), raios X, raios catódicos, além de prótons, nêutrons e elétrons de alta energia. O principal alvo que leva a perda de viabilidade é o DNA. Na radiação ionizante, um átomo emite elétrons de alta energia, que ionizam sua molécula. O elétron é ejetado e absorvido por outro átomo, criando uma cadeia de ionizações na substância irradiada. Essa atividade excita grupos químicos como o DNA, causando a produção de radicais químicos altamente reativos, os quais podem alterar grupos químicos e quebrar as fitas de DNA, causando mutações. A morte celular resulta da formação de uma cadeia de ionização numa porção significativa do DNA.

24. 2 – Esterilização e Desinfecção por Agentes Químicos A utilização do calor úmido é, de longe, a técnica mais utilizada para esterilização de equipamentos, entretanto, quando o equipamento ou componentes de uma instalação não pode ser exposto ao vapor de água. Germicidas químicos São agentes sanitizantes líquidos e agem a temperatura ambiente, necessitando de tempos de contato maiores para produzir o efeito desejado. Sua capacidade sanitizante está relacionada as propriedades físicas do material, tais como: Material plástico ou metálico; Superfície lisa ou rugosa; Porosidade; Presença ou ausência de locais de difícil acesso. Também influenciam no processo as características químicas do ambiente, tais como: pH; Presença de matéria orgânica contaminante; Formação de filmes e depósitos de material; Dureza da água utilizada na diluição do princípio ativo; Presença de resíduos de sabão.

25. Em virtude das grandes infecções hospitalares (especialmente bactérias patogênicas resistentes) muitos estudos foram realizados com relação aos germicidas. A partir destas pesquisas chegou-se a uma classificação quanto a resistência a germicidas químicos pelos microrganismos.

26. Utilização típicas de germicidas químicos

27. Esterilização de Meios de Cultura por Aquecimento com Vapor

28. Esterilização de meios de cultura Os meios de cultura devem ser esterilizados para que todos os contaminantes (microrganismos estranhos) que estão presentes no ar, água, equipamento, vidraria, e no próprio meio de cultura sólido sejam retirados para não consumirem o meio de cultivo, competindo assim com os microrganismos responsáveis pela fermentação desejada. Exemplos: produção de enzimas, vitaminas, antibióticos, etanol, etc. Há casos, porém, que a presença de contaminantes pouco ou nada interfere no processo. O bom andamento do processo é assegurada pelas próprias condições de trabalho, sendo dispensável eliminar eventuais contaminantes. Exemplos: fermentação lática de hortaliças, tratamento de resíduos biológicos, produção de vinagres, lixiviação bacteriana de minérios. Em resumo, o grau de eliminação de contaminantes com o objetivo de obter bons resultados depende de cada caso. Exemplo: a eliminação completa de contaminantes do caldo de cana-de-açúcar para produção de etanol inviabiliza o processo economicamente.

29. Descrição dos processos de esterilização por calor úmido Os dois processos industriais mais importantes são o modo de operação contínuo e descontínuo. Descontínuo (batelada) O meio de cultura é colocado dentro do fermentador, assim, esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser realizado de duas maneiras: Aquecimento com vapor direto: borbulha-se vapor diretamente no meio. Acarreta uma diluição do meio na ordem de 10 a 15% como conseqüência da condensação do vapor injetado; Aquecimento com vapor indireto: passa-se vapor por uma camisa que envolve o fermentador ou serpentina mergulhada no meio. Em qualquer dos casos, o meio é agitado mecanicamente, a fim de homogeneizar a temperatura em todos os pontos do sistema.

30. Na esterilização descontínua distinguem-se três fases: a) Aquecimento: eleva a temperatura inicial do meio (T de preparo) até a temperatura de esterilização (geralmente 121°C); b) Esterilização: temperatura na qual é mantida constante durante o intervalo de tempo da esterilização; c) Resfriamento: realizado com o auxílio da serpentina ou camisa, passando-se água fria, até a temperatura atingir a temperatura de fermentação. A rigor, a destruição dos microrganismos não se dá somente na fase de esterilização. Durante o aquecimento e resfriamento, enquanto a temperatura for superior a temperatura mínima letal (80 a 100°C), também ocorre destruição dos microrganismos. Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por processo descontínuo.

31. Vantagem: • Esterilização do meio de cultura e do fermentador simultaneamente, diminuindo os riscos de contaminação nas operações de transferência do meio para a dorna. • Desvantagens: • Manutenção do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 100°C) por períodos longos (horas): favorece o desenvolvimento de reações químicas no meio com possíveis alterações indesejadas em sua composição. Exemplo: caramelização da sacarose; • Elevados consumos de vapor e de água: conseqüentes da eficiência baixa do sistema de troca de calor; • Problemas de corrosão: ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com o meio aquecido; • tempo ‘não produtivo’ muito elevado: no período de esterilização, o fermentador é utilizado como um tanque de esterilização, sem produção.

32. Contínuo O meio de cultura é esterilizado antes de entrar no fermentador através do sistema mostrado abaixo: Mistura do meio com o vapor: atinge a T de esterilização Tubo de espera: termicamente isolado dimensionado de modo que o tempo de espera seja igual ao tempo de esterilização Trocador de calor de placas ou de tubos Preaquecimento: utilizado como fluido de resfriamento Trocador de calor onde a T é reduzida até a T de fermentação

33. Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por processo contínuo. Neste caso, a destruição dos microrganismos durante o aquecimento e resfriamento pode ser desprezada.

34. Contínuo X Descontínuo • O processo contínuo de esterilização do meio de cultura apresenta algumas vantagens com relação ao processo descontínuo, a saber: • Menor destruição de nutrientes do meio de cultura: por trabalhar com T mais elevadas e por ser um processo mais rápido tanto no aquecimento como no resfriamento, o tempo de permanência do meio em T elevada é relativamente pequeno (10 a 15 min). As fermentações que utilizam esterilização do meio de cultura por processo contínuo apresentam maior rendimento do que as realizadas com meio esterilizado por processo descontínuo. • Evita contaminação metálica do meio de cultura com a parede do tubo: tubo de espera com dimensões pequenas. • Dispensa a utilização de motores de potência elevada para acionamento dos agitadores, como no processo descontínuo: especialmente quando o meio é viscoso ou de alta densidade. • Economia de vapor, e de água de resfriamento, em relação ao processo descontínuo. • Os esterilizadores contínuos podem também serem utilizados nos processos de cozimento e sacarificação de matérias-primas amiláceas.

35. Esterilização de Ar

36. Esterilização de Ar • As espécies microbianas suspensas no ar atmosférico, assim como sua concentração, podem ser extremamente variáveis. Esses microrganismos são provenientes de: • solo: ventos • água: gotas d’água que se desprendem da superfície • irrigação com efluentes de esgoto • colheitas • abatedouros • criação de animais • depósitos de resíduos

37. Principais tipos de microrganismos encontrados no ar - Esporos de fungos constituem a maioria. ex. Cladosporium, Aspergillus • Bactérias esporulantes (endósporos) • Podem atingir grandes altitudes, até 5000 m, e distâncias intercontinentais.

38. Métodos para a esterilização de ar Aquecimento Radiações Filtração

39. Esterilização por aquecimento Esterilização de ar por calor seco  utilizada para pequenas instalações - laboratório - escala piloto Em biorreatores industriais (grande porte)  necessidade de vazões de ar elevadas. Dificuldade no aquecimento de grande volume de ar e sua permanência em temperatura elevadas. O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores elétricos, onde o ar é aquecido, e mantê-lo pelo tempo necessário a altas temperaturas. É também possível esterilizar o ar que sai do biorreator, fazendo-o passar por um segundo sistema, para o caso de fermentação com patógenos.

40. Equipamento para esterilização de ar por aquecimento através de resistores elétricos

41. Esterilização por radiação Teoricamente muitas radiações podem ser utilizadas para esterilizar o ar, entretanto apenas as radiações ultravioleta encontram aplicação prática. Baixo poder de penetração Longos períodos de exposição Inviabilidade do processo As radiações ultravioletas são utilizadas no interior de salas ou câmaras para esterilização do ar circundante e de mesas, uma vez que o ar introduzido nestes locais é previamente esterilizado por filtração.

42. Esterilização por Filtração A esterilização do ar por filtração é a solução mais adequada para a obtenção de altas vazões de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos envolvidos e de filtros bastante confiáveis. Por esses motivos a filtração é utilizada em praticamente todas as instalações industriais. Filtros de materiais fibrosos: filtros de lã de vidro Poros ou interstícios entre as fibras (por onde passa o ar) são de dimensões maiores do que o diâmetro das fibras – fibras com diâmetro de 3 m a 19 m. Operação de filtração em profundidade, pois as partículas são retidas ao longo de toda altura da camada filtrante. Retenção dos microrganismos por impacto direto e retenção mecânica. Filtração em profundidade

43. Esquema de um filtro tradicional de lã de vidro para a esterilização de ar. Recipiente em aço inoxidável, com dimensões na ordem de 2 a 3 m de altura e 1 a 1,5 m de diâmetro. OBS: O ar que passa através da camada filtrante deve ter a T superior (40 a 50°C) a T ambiente para evitar condensação de umidade. Vapor utilizado para a esterilização do filtro antes de iniciar o fornecimento de ar para o fermentador. Após o filtro é seco com ar aquecido. Lã de vidro

44. Filtros de Membranas Filtros de membranas microporosas, elaborados com material polimérico, por exemplo politetrafluoretileno (PTFE – teflon). Poros de dimensões menores do que os microrganismos a serem retidos (0,2 m, 0,22 m ou 0,45 m). Retenção dos microrganismos por impacto direto na superfície do elemento filtrante. Filtros hidrofóbicos: sem água na superfície do filtro diminui o crescimento microbiano, diminuindo a possibilidade de enviar ar contaminado para o biorreator. Retenção na superfície

45. Filtros HEPA (HighEfficiencyParticulateAir) • São empregados para a filtração do ar em câmaras de fluxo laminar de segurança biológica ou em “salas limpas”. • Permitem a retenção de pelo menos 99,97% das células e esporos microbianos ou outras partículas presentes no ar. • Removem partículas com diâmetro médio de 0,3 m a 0,5 m. • São montados com vários elementos filtrantes separados por folhas de alumínio, obtendo-se grande área para a passagem do ar e a utilização de ventiladores ao invés de compressores de ar, devido a baixa perda de pressão através do leito filtrante.