Terapia genética no controlo da dor crónica

1. Serviço de Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Terapia genética no controlo dador crónica Francisca Santos Nilza Pinto Orientadoras Dra. Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares Maio 2005 Porto

2. «An unpleasant sensory and emotional experience which we primarily associate with tissue damage or describe in terms of tissue damage, or both»(IASP)

3. Sistema endógeno de controlo da dor

4. Um dos tratamentos mais utilizados no alívio da dor crónica são opiáceos como a morfina e compostos similares. • efeitos colaterais • habituação

5. Terapia genética tratamento alternativo

6. Tecnologia cujo objectivo é corrigir a expressão de genes alvo implicados no desenvolvimento de doenças: • - Sobre-expressar esse gene alvo • - Ou diminuir a sua expressão • Através do uso de vectores que transportam o gene terapêutico até às células-alvo.

7. Tipos de vectores: víricos e não víricos • Os mais utilizados são os víricos • Penetram naturalmente nas células Os vectores víricos são derivados de vírus por substituição da componente patogénica por genes terapêuticos.

8. Terapia genética da dor Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal Fink et al., apresentado ao NIH Pohl et al., 2003

9. Terapia genética da dor Utilização de vectores víricos que promovem a libertação de opiáceos na medula espinhal Fink et al., apresentado ao NIH

10. Outros alvos: Regiões do encéfalo que controlam a transmissão da dor na medula a partir de determinadas estruturas do bolbo raquidiano Bolbo raquidiano ventrolateral antinociceptivo VLM

11. Injecção do HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1) VLM activar os neurónios antinociceptivos do VLM

12. ICP4 ICP4 TK UL US hCMV-P PA lacZ Construção do vector • Delecção do gene ICP4 Não replicativo • Inserção da cassete (promotor de citomegalovírus e transgene) no gene da timidine kinase • Transgene lacZ: beta galactosidase detectada por imunocitoquímica

13. Com base em estudos prévios: - Os estudos de marcação retrógrada com traçadores neuroanatómicos mostraram que os corpos celulares dos neurónios aferentes ao VLM ocorriam no encéfalo e na medula espinhal Mas, com o HSV-1 só se observaram corpos celulares que exprimiam a beta-galactosidase em alguns núcleos do encéfalo. Não foram detectados corpos celulares na medula espinhal - O HSV-1 tem grande afinidade pelos neurónios e migra retrogradamente do terminal axonal até ao corpo celular SELECTIVIDADE DE MIGRAÇÃO?

14. Detectar o DNA do vector para concluir sobre a sua migração Objectivo dotrabalho Tentou-se encontrar o genoma vírico na medula espinhal por PCR

15. Metodologia • Injecção estereotáxica do vector no VLM • Sacrifício por decapitação (10 dias após injecção) • Dissecção: • 1) Bolbo raquidiano (imunocitoquímica) • 2) Medulas (DNA) Medulas:Bolbos: Extracção de DNA Cortes de congelação PCR Imunocitoquímica Electroforese

16. Injecção estereotáxica do vector

17. - Com a suspensão vírica n=4 - Com soro fisiológico n=1

18. Dissecção do bolbo e medula • Decapitação 10 dias após injecção • Dissecção • Rato C+ e C-: bolbo congelado a – 80ºC • Restantes: • bolbo fixador (paraformaldeído 4% - 4h-sacarose 30%) • medula espinhal (alargamentos cervical e torácico) congeladas a -80ºC

19. Reacção imunocitoquímica de detecção da beta-galactosidase • Metodologia • A) Cortes finos (40µm) no micrótomo de congelação dos bolbos fixados • B) Reacção imunocitoquímica • Objectivo: verificar local de injecção

20. Anticorpo secundário Anticorpo primário Beta-galactosidase

21. Extracção de DNA • Objectivo : Extracção de DNA para posterior amplificação por PCR • Material • Bolbos dos C+ e C- • Medulas dos animais com injecção no VLM • Metodologia -Digestão com proteinase K - Precipitação das proteínas - Precipitação do DNA com isopropanol - Ressuspensão do DNA em 20µl de água bi-destilada - Quantificação do DNA pela leitura da densidade óptica a 260nm

22. PCR • Princípio da técnica : O PCR (PCR - Polymerase Chain Reaction) permite seleccionar e amplificar sequências específicas de uma cadeia de DNA graças à utilização de oligonucleotídeos : “primers” • Vários protocolos • Primers para amplificar o transgene lacZ da construção vírica • 95ºC- 45 sec • 60ºC- 30 sec • 72ºC -45 sec • 30 ciclos • Primers para amplificar o gene da timidina kinase do HSV-1 • Optimizar o protocolo

23. Electroforese • Gel de agarose a 2% • Visualização das bandas de DNA depois à adição de brometo de etídio

24. Resultados - Reacção imunocitoquímica : local de injecção Os ratos cujo local de injecção estava no VLM foram utilizados para amplificação do DNA vírico na medula

25. ICP4 ICP4 UL US TK hCMV-P PA lacZ L R Controlo+ Controlo- Branco Rato1 Rato2 Rato3 200pb Amplificação do gene lacZ no alargamento torácico da medula espinhal

26. TK TK hCMV-P PA lacZ L R Amplificação do gene da TK nos segmentos torácicos da medula espinhal 60ºC 62ºC A B A B • Optimização do protocolo • DNA do controlo+ • Temperatura de annealing a 60 e 62ºC • Concentração de MgCl2 (cofactor da Taq Polimerase) a A:2,5mM e B:4mM • Betaina optimiza condições de PCR estabilizando o DNA • Condições escolhidas Temperatura de annealing 60ºC -2,5mM de MgCl2 • 95ºC-45sec • 60ºC-30sec • 72ºC-45sec • 30 ciclos 300pb

27. Controlo+ Controlo- Branco Rato1 Rato2 Rato3 300pb 300pb Amplificação do gene da TK nos segmentos cervicais e torácicos da medula espinhal Alargamento cervical • Mesma quantidade de DNA total por amostra:5000ng/microg • Diferenças de quantidade de DNA vírico no alargamento cervical e torácico Alargamento torácico

28. Perspectivas futuras: 1- Questão técnica: quantificação de DNA por real time PCR ou DNA standard 2- Alargar o estudo a áreas encefálicas para aprofundar a selectividade da expressão beta-galactosidase 3- Esclarecer os mecanismos que impedem a detecção da beta-galactosidase

29. Bibliografia • Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of cronic pain. Experimental Neurology. 2003 Jun; 184(2003)S25-S29 • Pohl M, Meunier A, Hamon M, Braz J. Gene Therapy of Cronic Pain. Current Gene Therapy. 2003 Mar; 3(3):223-38 • Wilson SP, Yeomans DC, Bender MA, Lu Y, Goins WF, Glorioso JC.Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephalin-enconding herpes virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999 Mar; 96(1999) • Wilson SP,Yeomans DC. Genetic Therapy for Pain Management. Current Review of Pain. 2000; 4:445-450 • Lopes JMC. Fisiopatologia da Dor. Biblioteca da Dor. Permanyer Portugal • http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genetherapy.shtml • http://www.dor.med.br/cronica2.html • http://www.pain-workshop.com/pain/pain1/content/html/pt/pain1_1.html

30. Agradecimentos • Dr.ª Isabel Martins e Prof. Isaura Tavares pela orientação facultada ao longo da realização do nosso trabalho; • Laboratório de Biologia Celular e Molecular e Instituto de Histologia e Embriologia Abel Salazar pelo espaço e material disponibilizado; • Dr.ª Sandra Rebelo pela amizade; • E, ainda, a todos os nossos amigos!