Enzimaktivitási módszerek: celluláz-aktivitás mérése

1. Enzimaktivitási módszerek: celluláz-aktivitás mérése

2. Enzimek a talajban • Enzimek: biológiai folyamatokat katalizáló biomolekulák • Enzimek nevezéktana: hagyományosan az általuk lebontott vagy felépített vegyület neve -áz végződéssel; újabban azonban új nevezéktan készült, amely pontosabban kategorizálja őket a katalizált reakció típusa alapján • Elhelyezkedésük a talajban: élő vagy elhalt sejtek, sejttöredékek citoplazmájában vagy azok külső felületéhez kötődve, vagy sejten kívül mint oldott molekula, vagy agyagásványokhoz adszorbeálódva, vagy kolloid rendszerekben

3. Enzimek mennyiségének mérése a talajban • Mintavétel • A méréshez meg kell akadályozni, hogy a mintavétel után a mintában további enzim- vagy a reakciótermékek fogyása játszódjon le • A leggyakrabban toluolt adnak a mintához, így a lebontó mikrobák ezt bontják és nem a talajba került enzimet; segíti a sejten belüli enzimek kibocsátását is • A talaj sterilizálásához nagy energiájú elektron-nyalábokat vagy gammasugárzást használnak: így ki lehet szűrni az élő sejtek által folyamatosan végzett enzimtermelést • Analitikai elemzés

4. Mérési eredmények kiértékelése • Nem lehet megkülönböztetni kísérleti úton, hogy a minta enzimtartalmának mekkora része milyen módon volt kötve • Nem a tényleges talajban lévő enzim-aktivitást mutatja meg, inkább egy potenciális maximumot: a valós aktivitást a szubsztrát pH-tól és hőmérséklettől függő koncentrációja befolyásolja • Mindezen hibákkal azonban a többi mikrobiológiai elemzési módszer is rendelkezik, ezzel viszont mennyiségi meghatározás is végezhető és jól kombinálható más módszerekkel

5. Cellulóz és celluláz I. • Cellulóz: növényi sejtfalak alkotóeleme, egy D-glükózból β (1-4) glikozidos kötéssel képződött polimer, vízben oldhatatlan • A természetben nagy mennyiségben fordul elő, így bontása létfontosságú • Cellulóz bontása a celluláz enzimmel történik: ez 3 enzimből áll: az exo- β-1,4-glükanáz a kristályos cellulózt, az endo- β-1,4-glükanáz a nem-kristályos cellulózt hasítja oligoszacharidokká, a β-glükozidáz pedig ezeket bontja egyszerű glükózzá • A bontás lassú, az avar típusától, a szubsztrát- és vízkoncentrációtól, pH-tól, hőmérséklettől erősen függ

6. Cellulóz és celluláz II. • A talajba kijutva celluláz enzimei más-más elhalt növényi alkotóelemeken adszorbeálódnak és eltérő ütemben szabadulnak fel • Bontás optimuma: pH=5-6, 30-50 °C • Főleg a rhizoszómában zajlik • Talajszárítás erősen visszaveti a folyamatot • A talajban lévő cellulázt nagyrész gombák termelik (Actinomyces képes megélni csak cellulózon mint szénforrás, anaerob körülmények között Clostridium) • Celluláz-aktivitás mérése a talajban a szubsztrát talajmintához adagolás hatására felszabaduló glükóz és szén-dioxid mennyisége alapján történik • Szubsztrát: gyapot-szálak, nyomjelzett cellulóz, karboxi-metil cellulóz (CMC), Avicel (savval részben hidrolizált mikrokristályos cellulóz)

7. Schinner és Von Mersi módszere (1990.) • Segédanyagok: 2 M, pH 5,5 acetát-pufferoldat, 0,7% Na-CMC sóoldat, a cukor meghatározásához 4 féle reagens: • A: Vízmentes Na2CO3 és KCN keverékének vizes oldata • B: Kálium-vas-hexacianid vizes oldata • C: Vas-ammónium-szulfát, nátrium-dodecil-szulfát és kénsav keverékének vizes oldata • glükóz-monohidrát oldat • Mérés menete: 10 g szántóföldi vagy 5 g erdei talajmintát (2 mm vízzel nedvesítve), 15 ml puffert és 15 ml CMC-oldatot kevertek egy Erlenmayer-lombikban, majd lefedve inkubálták 50 °C-on 24 órát • Belső standardnak 15 ml CMC-t kevertek hozzá szűrés előtt, majd leszűrték, a szűrletet hígítva mintát vettek • 1-1 ml A, B reagenst hozzáadva 15 percet forralták 100 °C-on, majd 5 perc 20°C-os hűtőfürdő után C reagensből adtak hozzá 5 ml-t és egy órát állni hagyták20°C-on • Megmérték a fényáteresztő-képességét 690 nm-en

8. Az oldatok részletes receptje • Ecetsavas puffer: 164,08 g nátrium-acetátot oldottak 700 ml desztillált vízben, 5,5-re állították a pH-t ecetsavval és 1000 ml-re hígították • 0,7 %-os CMC-só-oldat: 7 g CMC-t oldottak 1000 ml ecetsavas pufferben és 2 órára 45 oC-on inkubálták, 4 oC-on egy hétig tárolható • A reagens: 16 g vízmentes Na2CO3-ot és 0,9 g KCN-otoldottak 1000 ml desztillált vízben • B reagens: 0,5 g kálium-vas-hexacianidot oldottak 1000 ml desztillált vízben; barna üvegekben tartandó! • C reagens: 1,5 g vas-ammónium-szulfátból, 1 g nátrium-dodecil-szulfátból és 4,2 ml cc. kénsavból 50 oC-ondesztillált vizes oldatot készítettek és 1000 ml-re hígították • glükóz-monohidrát oldat: 28 mg glükóz-monohidrátot oldottak 1000 ml desztillált vízben

9. A módszerről levont következtetések • Csak az endoglükanáz és a β-glükozidáz mennyisége mérhető így, az exoglükanázé nem • A módszer főleg a nedves erdőtalajok mérésére adott jó eredményt • A bomlás sebessége az időtől nem lineárisan függ • A bontást zavaró más vegyületek: nagy koncentrációban jelenlévő sók, ezüst, ammónium-ion, oxalátok stb. , a talaj egyéb mikrobiális paraméterei viszont nem befolyásolják • Toluolos kezelés nem változtatta meg az eredményt számottevően • A pH kontrollja fontos: A és B oldatok hozzáadása után pH>10,5, C oldat hozzáadása után pH<2 legyen • A cianid alkalmazása kiváltható hidrogén-peroxidos, savas közegben történő oxidációval

10. Hope és Burns módszere (1987.) • Segédanyagok: azidos,0,1 M, pH 5,5 acetát-pufferoldat, Avicel (por), a cukor meghatározására 7 féle reagens: • I. oldat: Na és K borkősavval alkotott sója, Na2CO3 és NaHCO3 vizes oldata • II. oldat: Na2SO4 vizes oldata • III. oldat: az első kettő keveréke • IV. oldat: CuSO4*5H2Oés Na2SO4 vizes oldata • V. oldat: a III. és a IV. keveréke • glükóz-monohidrát oldat • arzenát-molibdát oldat • Mérés menete: Erlenmeyer-lombikba mértek 1 g nedves talajt, 5 ml acetát-puffert és 0,5 g Avicelt, lezárva 16 órát inkubálták 40°c-on, majd belső standardnak Avicelt hozzáadva, centrifugálták. • 1 ml mintát véve, azt 1 ml V. oldattal 20 percet forralva, majd lehűtve és 1 ml arzenát-molibdát oldatot, majd 3 ml desztillált vizet hozzáadva megmérték a fényáteresztő-képességét 520 nm-en.

11. Az oldatok részletes receptje • Azidos acetát-puffer: 13,6 g nátrium-acetát-tetrahidrátot oldottak 700 ml desztillált vízben, majd a pH-t 5,5-re állították ecetsavval. Hoozáadtak 2 g nátrium-azidot és 1000 ml-re hígították az egészet. • I. oldat: 15 g-ot Na és K borkősavval alkotott sójából, 30 g Na2CO3-ból300 ml desztillált vízben oldatot készítettek, és ebben 20 g NaHCO3-otoldottak fel • II. oldat: 180 g Na2SO4 oldata 500 ml desztillált vízben; kiforralták belőle az oldott oxigént, majd hagyták lehűlni • III. oldat: az első kettő keveréke 1000 ml-re hígítva • IV. oldat: 5 g CuSO4*5H2Oés 45 g Na2SO4 oldata 250 ml desztillált vízben • V. oldat: a III. és a IV. 1:1 arányú keveréke (frissen keverték) • glükóz-monohidrát oldat: 79 mg glükóz-monohidrátot oldottak 1000 ml desztillált vízben • arzenát-molibdát oldat: 25 g ammónium-molibdátot oldottak 450 ml desztillált vízben és 21 ml cc. kénsavat adtak hozzá kevergetés mellett. 25 ml NA2HAsO4* 7 H2O oldatot adtak hozzá (3 g só 25 ml vízben). 2 nap 37 oC-on történő állás után barna üvegekbe töltötték. Használat előtt egy egységnyi ilyen oldattal 2 egységnyi 0,75 M kénsavat kevertek.

12. A módszerről levont következtetések • Az enzimreakció lineáris volt 16 órán keresztül • Az azid inhibitorként működött: megakadályozta a keletkezett cukrok baktériumok általi elfogyasztását, de hatását minden talajtípusnál külön ellenőrizni kell, mert nem univerzális • A módszer nem különbözteti meg a különböző celluláz-enzimeket • Magas glükóz-oxidáz koncentráció a talajban meghamisítja ennek a mérési módszernek az eredményét

13. Alternatív módszerek • A szubsztrátként szolgáló cellulóz lehet szűrőpapír, cellubióz, HEC (hidroxi-etilcellulóz) stb. is; lehet oldott (Avicel) vagy oldahtatatlan (szűrőpapír) formában a mérés során • Citromsavas pufferoldatokat is szokás alkalmazni • A keletkezett cukor mennyisége dinitroszalicilsav alkalmazásával is megbecsülhető • Az egyes mikroba-fajok egész celluláz enzimrendszerekkel rendelkeznek, amelyekben az említett 3 enzim működését más enzimek is segítik; ezekre is vannak mérési módszerek • Az egész téma, mind a talaj celluláz-aktivitásának megmérése, mind a celluláz-enzimrendszer működése és a talajban történő cellulóz-lebontás sebessége erősen kutatott téma, ahol még sok megoldandó problémával néznek szembe a kutatók.

14. Források • Methods in Applied Soil Miccrobiology and Biochemistry, Chapter 7: Enzime activities (a bevezető: 311-312. oldal és K. Alef és P. Nannipieri cikke a 345-349. oldalon) (1995, Academic Press Ltd.) • Az Avicelről: http://www.answers.com/topic/avicel • T. K. GHOSE (INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY):MEASUREMENT OF CELLULASE ACTIVITIES • Kép forrása: http://akciospotencial.blog.hu/2007/10/21/title_13504