640 likes | 901 Views
Hvordan kan modifisering av histoner påvirke kromatin?. Tradisjonell forklaring: Modifisering vil påvirke histonenes ladning, noe som igjen vil kunne gi en endret nukleosomstruktur og endrede egenskaper
E N D
Hvordan kan modifisering av histoner påvirke kromatin? • Tradisjonell forklaring: Modifisering vil påvirke histonenes ladning, noe som igjen vil kunne gi en endret nukleosomstruktur og endrede egenskaper • Nyere forklaring: Modifiserte aminosyrerester i histonene utgjør bindingsseter for andre proteiner som så avgjør kromatinets videre skjebne
Histoner og histongener • Pattedyr har 10-20 kopier av hvert histongen, Drosophila rundt 100 • Sære gener, vanligvis uten introner • Ingen polyadenylering av histon-mRNA • Histonene kan foreligge i flere varianter i en organisme
Den repeterende enhet i histongen-clusteret hos en rekke organismer Page 1441
Acetylation Methylation Phosphorylation Ubiquitination ADP-ribosylation Halene på histonene modifiseres som signaler til transkripsjon
Aktivt og inaktivt kromatin • Actively transcribed chromatin • is euchromatic, • has particular histone amino groups acetylated, • is less methylated than inactive chromatin, and • has sites that are hypersensitive to DNase I digestion. • Inactive chromatin associated with: • a morphologically condensed state (heterochromatin) • deacetylated, methylated histones, • methylated DNA, • resistance to DNase I.
Kombinasjoner av modifikasjoner forbundet med aktivt og inaktivt kromatin
Synergistiske og antagonistiske modifikasjoner i halen av H3 og H4
Proteolytisk modell for fjerning av stabil metylering fra histon H3
MeCP2 – et protein som bindes til metylert DNA • Bindes spesifikt til metylert DNA via et metyl-CpG-bindende domene • Rekrutterer transkripsjonsrepresjonskom-plekset mSin3A/HDAC • Kan ”invadere” kromatin på en metyleringsavhengig måte og forskyve histon H1 fra kromatin in vitro • Mutasjoner i mSin3A kan føre til Retts syndrom, en nevrologisk sykdom som stort sett rammer jenter Symptoms:Girls with Rett Syndrome appear to develop normally until 6 to 18 months of age. They then enter a period of regression, losing speech and hand skills they had acquired. Most girls develop seizures, repetitive hand movements, irregular breathing and motor-control problems. A slowing of the rate of head growth may also become apparent. The girls can live to adulthood, but most never regain the ability to use their hands or to speak.
RNA interference Animation
Kobling transkripsjon-translasjon • Koblet translasjon /transkripsjon i prokaryoter • Adskilt i eukaryoter
Tre typer endringer • Spalting, fjerning av sekvenser • Ekso- eller endo-nukleolytisk spalting • Spleising • Påsetting av nukleotid(er) • 5´-ende og 3´-ende • Modifikasjon av spesifikke nukleotider
Tre grupper RNA å modifisere • Pre-mRNA • Påsetting • Spleising • Ribosomal RNA • Spalting • Påsetting • tRNA • Spalting • Modifikasjon
Pre-mRNA prosessering Prokaryoter: primær transkript = mRNA Eukaryoter: transkripsjon/ translasjon adskilt, mRNA modifisert i kjernen før translasjon i cytosol
Pre-mRNA (hnRNA) AAAAAAAAAAAAA cap mRNA Transkripsjon - prosessering Koblede prosesser
Påsetting i 5´-ende:capping • Cap: 3 modifikasjoner • 7-Me-guanosin koblet til 5´-ende • Kobling via 5´-5´trifosfatbro • Skjer kotranskripsjonelt • O2´-metylering av ribose • Cap2, Cap1 (multicellulær), Cap0 (unicellulær) • N6-metylering av adenin Cap-1 Cap-2
Enzymer som deltar • Capping skjer når RNA bare er 25-30 baser langt - altså kotranskripsjonelt • cap bindes til et ”Cap binding complex” CBC • CBC stimulerer spleising og 3´-endeprosessering • 3 enzymer deltar • 1.Trifosfatase fjerner et fosfat • 2. Guanylyl transferase kobler på GMP • 3. 7-metyltransferase modifiserer terminalt guanosin • Fosforylert CTD rekrutterer capping enzym
AAAAAAAAAAAAA cap Modifisering av 3´- ende:poly-adenylering • Definert 3´-ende dannes ikke via terminering, men via prosessering • Pre-mRNA heterogene 3´-ende, • mRNA veldefinert 3´-ende • Poly(A) haler påsettes i 3´-ende • 20-50x A-strekk i en egen prosess • dvs poly(A) ikke genkodet
cap Upresis terminering 0 0 Presis ende via Spalting og polyadenylering AAAAAAAAAAAAA cap Trimming av 3´-ende
Poly-adenylering - to-trinns prosess • Spalting 15-25 nedenfor AAUAAA • Innen 50 nt før et mindre konservert (G)U-rikt område • Poly(A) hale lages av poly(A) polymerase • Koblet: • AAUAAA binder CPSF • Cleavage and polyadenylation specificity factor • Bundet CPSF stimulerer poly(A) polymerase
Prosessering i 3´-ende:Kotranskripsjonelle prosesser • Når RNAPII nærmer seg 3´-enden av transkriptet, skjer flere koblede prosesser • Spleising av terminalt intron • spalting ved poly(A)-setet, • påkobling av poly(A)-hale, • terminering nedstrøms for poly(A)-setet og frigjøring av RNAPII • Disse prosesser avhenger av CTD • ”Cleavage-polyadenylation specificity factor” CPSF og ”cleavage stimulation factor” CstF binder spesifikt til CTD og finnes assosiert med holoRNAPII.
Hvorfor poly(A)?Klippekort-hypotesen PABP AAAAAAAAAAAAA • Poly(A) beskytter mRNA mot degradering i cytosol • Poly(A) bindes til PABP • Poly(A) forkortes ettersom mRNA translateres cap AAAAAAAAAA cap AAAAAAA cap AAAA cap A cap ustabil
Spleising • Kodende sekvens er i eukaryoter oftest stykket opp • avbrutt av ikke-kodende regioner • Heterogent nukleært RNA • hnRNA 2 - 20 kb • Større enn proteinet skulle tilsi • Rask turnover • 1977: pre-mRNA har introns • Som blir fjernet ved spleising
Eksempel: ovalbumin • Presisjon - leseramme beholdes • Rekkefølge av eksoner beholdes • Introner er som oftest større enn eksoner
Sekvenssignaler som definerer introner • Invariant GU i 5´-spleisesete (5´ss) • Invariant AG i 3´- spleisesete (3´ss) • Forgreningspunktsekvens (BPS) • Polypyrimidinstrekk (Py tract) Poly-Y tract Likevel så degenerert at dataprogram bare klarer 50% treff i prediksjon
Mekanisme:via 2 trans-forestringer • Trinn 1 - dannelse av lassostruktur (lariat) • Ekson-intron (5´)- brudd og ekson release • Bro 2´-5´-fosfodiester • A i forgrening: • CURAY konsensus • 20-50 foran 3´-spleisesete
Mekanisme:via 2 trans-forestringer • Trinn 2 - fusjon av eksoner • Fri 3´-OH fra ekson N danner fosfodiester binding med 5´-fosfat i ekson (N+1) • Avspaltet lariat-intron blir raskt degradert • Uten tilførsel av fri energi
”Snurps”Hvert signal binder en snRNP • Small nuclear RNA • snRNAs binder protein • og danner: • Small nuclear ribonucleoproteins • Disse gjenkjenner ulike splice-signaler, noen via base-paring
Spleisosomet utfører spleising • Spleisosomet = 5 snRNP + proteiner = 50-60S • U1, U2, U4, U5 og U6 snRNP • Mange andre non-snRNP proteiner • Trinnvis assembly • 5´ss bindes av U1 snRNP (E kompleks) • Poly-Y + 3´ss bindes av U2AF • Forgrenings-A bindes av U2 snRNP • ATP-avhengig trinn • U4/U6-U5 tri-snRNP assosieres og et kompetent spleisekompleks dannes
Bro-dannelse: over ekson og over intron • SR-proteiner deltar
Hvorfor spleising? • Genetiske fossiler eller … • ….nyttig mekanisme?
Nytte:Alternativ spleising • En måte å øke proteindiversitet uten å øke antall gener • Drosophila Dscam-genet genererer 38016 isoformer • 576 alternativt spleisede former av K+-kanal i fugleøre-reseptorer (rolle i gjenkjenning av lydfrekvenser) • Genomsammenligning • Humane genom bare 30-40 000 gener • Mer alternative spleising enn i lavere organismer • 3.2 alternative spleiseformer pr humant gen • 1.34 alternative former pr gen i C.elegans
Eksempel: a-tropomyosin • 7 Celletypespesifikke varianter
Mange måter å variere på • Alternative 5´-spleiseseter (a) • Alternative 3´- spleiseseter (b) • Ekson skipping/inklusjon (c) • Alternativ eksonbruk (d) • Intronretensjon (e)
Alternative initieringsseter(alternative 1. eksoner) • Alternative 1. eksoner ≈ alternative promotere • Benyttes hvor separat regulering/nivå er nødvendig • -amylase