Présentée par Laurence AUTRET Le 14 décembre 2005 Directeur de thèse : G. DESMADRYL

1. ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU CALCIUM AU COURS DU DEVELOPPEMENT ET DE LA MATURATION DES NEURONES GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE SOURIS Présentée par Laurence AUTRET Le 14 décembre 2005 Directeur de thèse : G. DESMADRYL Unité 583 INSERM, INM, Montpellier, France

2. Système vestibulaire Ganglion Vestibulaire Organe Vestibulaire Cochlée Oreille interne

3. Ganglion vestibulaire Le ganglion vestibulaire contient les corps cellulaires des neurones qui connectent les cellules sensorielles et les noyaux vestibulaires

4. Maturation du système vestibulaire

5. Ca v1.1  1 S Ca v1.2  1 C Type L Ca v1.3 H A U T  1 D S E U I L Ca v1.4  1 F Type P/Q Ca v2.1  1 A Type N Ca v2.2  1 B Type R Ca v2.3  1 E B A S Ca v3.1  1 G Type T S E U I L Ca v3.2  1 H Ca v3.3  1 I Canaux calciques dépendants du potentiel Deux grandes familles de courants calciques déterminées par leur seuil d’activation Dans les courants calciques à haut seuil d’activation, plusieurs sous-types caractérisés par leur pharmacologie

6. Electrophysiologie

7. Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à haut seuil d’activation au cours du développement Les conductances de type L restent constantes au cours du développement. Les conductances de type N augmentent progressivement au cours du développement. Les conductances de type P présentent un pic d’expression à E17 puis diminuent au cours du développement. Les conductances de type Q augmentent jusqu’à la naissance puis restent constantes. J.Physiology 1999, 518.1 Chambard and coll.

8. Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à bas seuil d’activation au cours du développement Le nombre de neurones exprimant un courant de type T diminue au cours du développement. Ils ne sont que 20% à la naissance. Lorsque la conductance de type T est présente, elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude. J.Physiology 1999, 518.1 Chambard and coll.

9. Développement du système vestibulaire et évolution des courants calciques de type T Proportion de cellules exprimant un courant calcique de type T L’expression des courants calciques de type T correspond à une période de pousse neuritique importante et de synaptogenèse

10. I- Caractérisation des sous-unités calciques de type T présentes sur le soma du neurone vestibulaire primaire II- Etude de l’activité électrique III- Rôle sur la pousse neuritique in vitro

11. Ca v1.1  1 S Ca v1.2  1 C Type L Ca v1.3 H A U T  1 D S E U I L Ca v1.4  1 F Type P/Q Ca v2.1  1 A Type N Ca v2.2  1 B Type R Ca v2.3  1 E B A S Ca v3.1  1 G Type T S E U I L Ca v3.2  1 H Ca v3.3  1 I ? Quelles sont les ou la sous-unités impliquées dans la genèse du courant calcique à bas seuil d’activation?

12. Caractérisation moléculaire par la technique de RT-PCR Les ARNm des trois sous-unités sont présents à E17

13. Caractérisation électrophysiologique Identification de deux populations de neurones en fonction de l’amplitude du courant calcique de type T Neurones avec un grand courant : amplitude > 200 pA Neurones avec un petit courant : amplitude < 60 pA

14. Cinétiques d’activation et inactivation Cinétiques d’activation et d’inactivation rapides des courants calciques de type T pour les deux populations de neurones : Cav3.1 and/or Cav3.2

15. Les neurones ayant un grand courant calcique de type T Constante de temps de déactivation= 5,28 ms à -60 mV et 0,52 ms à -140 mV : Cav3.2 Constante de temps de réactivation= 1394 ms (lente) et 117 ms (rapide) :Cav3.2 IC50 = 13,4 µM, grande sensibilité au Nickel : Cav3.2 La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par Cav3.2

16. Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité

17. Identification d’une nouvelle propriété de la sous-unité Cav3.2 : mécanosensibilité Neurones vestibulaires ayant un grand courant calcique de type T Canaux calciques de type T recombinants Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité. Cet effet est réversible

18. Les neurones ayant un petit courant calcique de type T Les observations faites sur cette population de neurones sont similaires à celles obtenues après application de 10 µM de nickel sur la population de neurones ayant un grand courant calcique de type T Constante de temps de déactivation= 8,6 ms à -60 mV et 1,1 ms à -140 mV Constante de temps de réactivation= 665 ms (lente) et 103 ms (rapide) Ce courant calcique de type T semble généré par Cav3.1

19. Conclusion La sous-unité Cav3.2 est majoritairement présente sur le soma des neurones vestibulaires à E17 Cette sous-unité s’active pour des potentiels proches du potentiel de repos de la cellule Quelle est l’implication du courant induit par cette sous-unité dans la forme du potentiel d’action?

20. Forme des potentiels d’action enregistrés à E17 Potentiel d’action avec une repolarisation rapide et une hyperpolarisation post potentiel (AHP) Potentiel d’action suivi d’une dépolarisation post potentiel (ADP) Induit par Cav3.2 ? Potentiel d’action avec un épaulement sur la phase de repolarisation Induit par Cav3.2 ?

21. Effet de l’application de nickel sur les différentes formes de potentiels d’action Le nickel induit une disparition de l’ADP L’activation de ce courant calcique de type T généré par Cav3.2 induit une dépolarisation post potentiel Ni2+

22. Etude du potentiel d’action avec ADP ou potentiel d’action calcique Corrélation entre la présence d’un grand courant calcique de type T et une ADP suivant le PA Le blocage des autres conductances calciques sont sans effet sur le PA La TTX ne bloque pas la genèse du potentiel d’action calcique Le grand courant calcique de type T est responsable de l’ADP ou PA calcique

23. Etude du potentiel d’action avec épaulement Quelle conductance ionique induit un épaulement lors de la phase de repolarisation du potentiel d’action au cours du développement ?

24. Etude du potentiel d’action avec épaulement Applications de 1µM et 10 µM de nickel n’ont pas d’effet sur l’épaulement mais sur l’ADP Application de 100µM de cadmium inhibe l’épaulement Application de 500 nM d’ω-agatoxine IVA (antagoniste de canaux de type P/Q) bloque l’épaulement du potentiel d’action L’ épaulement semble généré par un courant calcique de type P

25. Conclusion Cav3.2 génère un courant impliqué dans l’activité électrique Présence d’une ADP et dans certains cas d’un potentiel d’action calcique. Augmentation de l’excitabilité cellulaire et entrée massive de calcium Rôle physiologique de cette activité électrique transitoire dans la neuritogenèse?

26. Rôle physiologique de ce courant calcique généré par Cav3.2 Modèle in vivo impossible Utilisation de culture de neurones vestibulaires primaires Pas de pharmacologie spécifique de ces canaux ioniques Utilisation de la stratégie antisens

27. ADNc ARNm Hybride ARN-ADN pas de traduction Principe de la stratégie antisens Technique qui permet de vérifier l’effet de la disparition d’une protéine

28. Etude de la pousse neuritique Cav3.2 Scramble Les antisens ont été incorporés dans les cellules en vert Les neurones sont marqués en rouge (neurofilaments)

29. Antisens anti Cav3.2 diminue la pousse neuritique Suppression du courant calcique de type T Diminution significative de la pousse neuritique dans les neurones transfectés avec l’oligonucléotide antisens de Cav3.2

30. Conclusion générale et perspectives Neurone vestibulaire PA avec ADP Pousse neuritique Effet sur la formation des synapses?? Cav3.2 Ca++

31. Conclusion générale et perspectives Cav3.2 Maturation des conductances potassiques Cav3.1 P/Q ??? PA avec épaulement Faible amplitude de courant Apparition plus précoce dans le développement? Rôle au cours du développement ?

32. Les oligonucléotides antisens sont dans le soma des neurones Images confocal Neurofilaments sont marqués en rouge Les oligonucléotides sont marqués en vert Les oligonucléotides ont été intégré le soma des neurones vestibulaires