PERSPECTIVAS DE LA RED QUE CONTROLA LA TRANSICIÓN G1/S EN LA GEMACIÓN DE LEVADURAS

1. INSIGHTS INTO THE NETWORK CONTROLLING THE Gl/S TRANSITION IN BUDDING YEAST PERSPECTIVAS DE LA RED QUE CONTROLA LA TRANSICIÓN G1/S EN LA GEMACIÓN DE LEVADURAS MATTEO BARBERIS & EDDA KLIPP Max-Planck-Institutefor Molecular Genetics, Berlin, Germany Humboldt UniversityBerlin, InstituteforBiology, Berlin, Germany

2. Replicación del DNA en la transición G1/S El desencadenamiento del proceso de los orígenes de replicación del DNA se modelo en tres pasos: • Eventos que suceden desde los orígenes de replicación libres, a la formación del complejo pre-replicativo (pre-RC). • La distancia entre los origines de replicación es fija. • Formación del complejo pre-RC en cada origen: 15 minutos (± 2 min). • El numero de orígenes de replicación se fijo en 440

3. Paso dependiente del complejo nuclear Cdk1-Clb5,6. • Activación de los origines de replicación por Cdk1-Clb5,6 determinada por la concentración te complejo en ese tiempo. • Concentraciones de 0.03 μM (± 0.01 μM). • Concentración de Cdk1-Clb5,6, los sustratos específicos son fosforilados y liberados de cada origen de replicación • Activación de los orígenes de replicación. • El tiempo para activar cada origen de replicación : 1 minuto (± 0.01 min.) • Activación del rigen de replicación • Replicación bidireccional del DNA de multiples orígenes de replicación.

4. Eventos relevantes en el desencadenamiento de la replicación del DNA Ensamble de los complejos en los orígenes de replicación. Fosforilación de lugares específicos como función de la disponibilidad de Cdk-1-Clb5,6. Se desencadena la replicación del DNA de manera bidireccional Nota: Cdt1 y Cdc6 son ejemplos entre muchas otras proteínas involucradas en el proceso

5. Condiciones nutricionales y replicación del DNA. • GLUCOSA • Con una concentración eficiente de Cdk1-Clb5,6 y siguiendo la degradación de Sic1, se obtiene un aumento brusco de la actividad de Cdk1-Clb5,6 (A). • Este aumento brusco a su vez permite la liberación fuerte y eficientemente de los orígenes de replicación (B).

6. ETANOL • Con etanol el complejo Cdk1-Clb5,6 es ineficientemente importado dentro del núcleo durante un largo periodo, resultando en un desencadenamiento espaciado de los orígenes (D). • Cdk1-Clb5,6 no puede activar el proceso de replicación en tiempo fisiológico, resultando en una fase S mas larga (E).

7. Disponibilidad nuclear de Cdk1-Clb5,6 y liberación de los orígenes de replicación de DNA. Simulación del mutante sic1Δ en un medio de glucosa. La cantidad de Cdk1-Clb5,6 en células silvestres es alrededor de siete a ocho veces mas grande que en las células sic1Δ. (Ver fig. Glucosa A) Escaso desencadenamiento de DNA en células mutantes que comienza mas temprano en células silvestre, ya que la degradación de Sic 1 es requerida y procede en forma lenta

8. . Los genes CLN3, FR1 y WHI5 son centrales en la transición G1/S. La sobre-expresión de Cln3 (OE-CLN3) conduce a superar la actividad inhibitoria de Far1. Esto acelera la formación de Cdk1-Cln1,2 resultando en un inicio anticipado de la replicación del ADN • La deleción de CLN3 (cln3) previene la formación del complejo nuclear Cdk1-Cln3 en el comienzo de G1/S, previniendo la activación de los factores de transcripción SBF/MBF

9. En células far1Δ no hay balance entre Far1 y Cln3 y los complejos: nuclear Cdk1-Cln3, citoplasmático Cdka1-Cln2 y nuclear Cdk1-Clb5,6; aparecen pronto, como resultado hay una ligera entrada en la fase S comparada con las células silvestres En la sobre-expresión de FAR1 (OE-FAR1) la formación del complejo nuclear Cdk1-Cln3 sucede de forma muy lenta. Este efecto propaga una baja formación de Cdk1-Cln2 y Cdk1-Clb5,6 dando como resultado una reducción en el numero de orígenes de replicación activados

10. (F) La sobre expresión de WHI5 (OE-WHI5) es una fuerte inhibición de los factores de transcripción SBF/MBF y se requieren mas complejos nucleares Cdk1-Cln3 para fosforilar a Whi5 y libera la inhibición. Por lo tanto la transcripción de Cln1,2 y Clb5,6 es disminuida resultando en una reducción de la formación de complejos con Cdk1 y una gran retraso en los eventos de replicación del DNA. (E) el mutante whi5Δ bloquea la inhibición inicial de los factores de transcripción SBF/MBF, el evento central de la transición G1/S y comienza la transcripción de los genes Cln1,2 y Clb5,6. La formación de complejos Cdk/ciclina se adelanta y el mutante se somete a la transición G1/S alrededor de 40 minutos antes que en células silvestres. Resultando en una temprana replicación del DNA.

11. El valor crítico del tamaño celular (Ps) en la dinámica de transición G1/S • El tamaño crítico de la célula (Ps), • Es un parámetro cuantitativo que caracteriza el crecimiento exponencial de la población. • Su valor puede ser estimado en función del contenido promedio de proteínas (una medida del tamaño celular). • La replicación del DNA comienza solamente cuando la célula alcanza el valor de Ps .

12. Fluctuación del valor Ps Los principales parámetros cinéticos que influencian el ajuste del tamaño crítico Ps, están relacionados en dos eventos regulatorios, los cuales controlan la entrada en la fase S. • El crecimiento dependiente implica la interacción del activador Cln3 que enlaza con la cinasa Cdk1 y el inhibidor Far1. La actividad Cdk1-Cln3 incrementa proporcionalmente los niveles de Cln3 y disminuye Far1, así el mecanismo que controla el inicio de la fase S es operativamente tan largo como Cln3 incremente más rápido que Far1. El umbral Cln3/Far1 indica la llegada del tamaño, cuando la cantidad de Cln3 (que incrementa la masa celular) supera la de Far1. Cdk1.Cln3 fosforila Whi5, conduciendo la activación de los factores de transcripción SBF/MBF, así se abre la vía que conduce la iniciación de la replicación del DNA. • El tamaño critico llega cuando las células superan el segundo umbral dependiente del balance entre la ciclina Clb5(el activador) y la Cki-Sic1 (el inhibidor). El análisis confirma que la coordinación secuencial entre los dos mecanismos umbrales regulan la masa crítica celular necesaria para someterse a la fase S, así efectivamente se acopla el crecimiento celular y el inicio de la replicación del DNA.

13. Fluctuación del valor Ps • Los principales parámetros cinéticos que influencian el ajuste del tamaño crítico Ps, están relacionados en dos eventos regulatorios, los cuales controlan la entrada en la fase S • El umbral Cln3/Far1 indica la llegada de Ps, cuando la cantidad de Cln3 (que incrementa la masa celular) supera la de Far1. Cdk1-Cln3 fosforila Whi5, conduciendo la activación de los factores de transcripción SBF/MBF, abriendo la vía que conduce la iniciación de la replicación del DNA. • El tamaño critico llega cuando las células superan el segundo umbral dependiente del balance entre la ciclina Clb5(el activador) y la Cki-Sic1 (el inhibidor). • La coordinación secuencial entre los dos mecanismos umbrales regulan la masa crítica celular necesaria para someterse a la fase S, así se acopla el crecimiento celular y el inicio de la replicación del DNA.

14. Tabla de parámetros cinéticos y sus reacciones correspondientes

15. Análisis de sensibilidad que muestra los cambios de Ps seguidos de la variación de parámetros cinéticos de 0.1 a 100 veces.

18. Conclusión • Una parte significativa de los eventos regulatorios en células vivas esta relacionada con el ciclo celular • La replicación del DNA es el principal evento que conduce el ciclo celular después de la transición G1 / S • De los análisis de sensibilidad del valor Ps, los parámetros cinéticos son importantes par la regulación de los eventos de G1 / S.