Enzymová kinetika

1. Enzymová kinetika

2. Enzymová kinetika • studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek • zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: • koncentrace substrátů • koncentraci enzymu • Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...) • Přítomnost aktivátorů a inhibitorů Proč studovat enzymovou kinetiku? • Charakterizace substrátové preference enzymů • Identifikace a studium inhibitorů

3. Typy enzymových reakcí Jednosubstrátové reakce • Jeden substrát jeden produkt (isomerasy) • Jeden substrát dva produkty (lyasy) • Jeden substrát a voda dva produkty (hydrolasy) Dvousubstrátové reakce • Dva substráty dva produkty (oxidoreduktasy, transferasy) • Dva substráty jeden produkt (lyasy) Třísubstrátové reakce • Dva substráty a ATP  jeden hlavní produkt a dva produkty z ATP (ligasy)

4. Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu • V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na fruktosu enzymem b-fruktofuranosidasou: • sacharosa + H2O glukosa + fruktosa • Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární

5. Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu • Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická

6. Enzymová kinetika Leonor Michaelis Maud Menten

7. Enzymová kinetika – matematické odvození Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci: S ===> P Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S]

8. Rovnice Michaelise a Mentenové k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES) K1je rychlostníkonstantapro tvorbu ES (rychlost = k1[E][S]) K-1jerychlostní konstantapro disociaci ES (rychlost = k-1[ES]) Celková rychlost reakceje:

9. Nemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit. • Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady: Rovnice Michaelise a Mentenové • 1. Předpokládáme, že k1 ak-1jsou podstatně větší než kcat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze. • V rovnováze je rychlosttvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže: • k1[E][S] = k-1[ES] • Po úpravě: • kde KSje definovánajakorovnovážná disociační konstanta.

10. Rovnice Michaelise a Mentenové 2.Předpokládáme žepočáteční koncentrace substrátu [S]o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E]tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa): tj.. [S]o >> [E]tottakže [S] ≈ [S]o Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.

11. E + S <===> ES ===> P + E Rovnice Michaelise a Mentenové Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (zavedení KS): Přeskupení: Tedy:

12. Rovnice Michaelise a Mentenové Totoje rovnice hyperboly. Pro [S] v kcat[E]totkterou definujeme jakovmax. Máme tedy: kde vmax = kcat[E]tot (Připomenutí: [S] ≈ [S]o a vje počáteční rychlost reakce.) zero order 1st order [S] = Low → High

13. v or [ES] Steady state Time Nemůžeme předpokládat, že k1 a k-1jsou vždy větší než kcat Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S]o >> [E]tot) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní. Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Předpokládáme tedy: Reakční schéma je: k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 reakční rychlost v = kcat[ES]

14. Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu Concentration Reaction Time S P ES E

15. v or [ES] Steady state Time k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea k1 [E][S] = k-1[ES] + kcat [ES] Úprava: Tedy: kde KMje známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta. Pokud k-1 >> kcat, KM KS (= k-1/k1).

16. Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup: Enzym není spotřebován: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (z výrazu proKM): Úprava: Tedy: kdevmax = kcat[E]tot. Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

17. Vmax[S] vo = Km+[S] Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím: Michaelis-Menten Briggs-Haldane

18. Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot 1/v KM/vmax 1/vmax 1/[S] -1/KM B-H poskytuje obecnějšírovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme: Graf 1/vproti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí KM/vmaxa úsekem na ose y o hodnotě 1/vmax Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

19. Km: Afinitavůči substrátu Vmax[S] vo = Km+[S] Vmax Ifvo = 2 Vmax Vmax[S] = 2 Km+[S] Km+[S] = 2[S] Km= [S] Km When using different substrate Vmax S2 S1 S3 1/2 S1S2S3 Affinity changes

20. Důležitost KM • Nezávisí na koncentraci enzymu • Závisí na reakčních podmínkách • Hlavní substrát má nejnižší KM • Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 KM

21. KM

22. Km: příklad hexokinasy CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Substrát Glukosa Allosa Manosa číslo 1 2 3 4 5 6 Km = 8 8,000 5 mM

23. Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, kcat k1 kcat E + S ES E + P (vo) k2 kcat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednu sekundu

24. Číslo přeměny vybranýchenzymů Enzymy Substrát kcat(s-1) KatalasaH2O2 40,000,000 Karbonát-hydrolyasaHCO3- 400,000 AcetylcholinesterasaAcetylcholin 140,000 2,000 b-LaktamasaBenzylpenicilin FumarasaFumarát 800 Počet molekul produktu získanéhoze substrátu jednou molekulou enzymuza sekundu Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

25. Jak stanovit KM aV 1 vo vo 1 Vmax - 1 Km 1/S S 1)použij známé množstvíenzymu→E 2)přidej substrátv různých koncentracích→S(osa x) 3)změř produkt v určeném čase (P/t) →vo(osa y) 4)(x, y) graf, hyperbolickákřivka, limita →Vmax 5)pokud y = 1/2 Vmaxspočti x ([S]) →Km Vmax 1/2 Km Double reciprocal Direct plot

26. Jednotky enzymovéaktivity Specifická aktivita y x = = tan S →Pmmol t Produkt [P] vo = [P]/min směrnice tan mmol /min Unit = 0 10 20 30 40 Reakčnídoba(min) Jednotky aktivity y Protein (mg) x

27. kcat/Km (katalytická účinnost) chymotrypsinu O RO H3C–C–N–C–C–O–CH3 HH = = – Norvalin –CH2–CH2–CH3 3.6 ╳ 102 – – Norleucin –CH2–CH2–CH2–CH3 3.0 ╳ 103 –CH2– Phenylalanin 1.0 ╳ 105 kcat / Km R = Glycin –H 1.3 ╳ 10-1 (M-1 s-1) Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

28. Vmax[S] vo = Km+[S] • přídavek enzymu (zvýšení [E]tot) • přídavek substrátu (zvýšení [S]) • modifikace enzymu(optimalizace kcatnebo KS) Jak zvýšit rychlost reakce

29. Kinetika vícesubstrátových reakcí • Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty • Reakce může probíhat různými mechanismy

30. Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný • Vazba prvého substrátu A změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu B (volný enzym má pro něj malou afinitu) vznik komplexu EAB • Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty) • Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu • Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD+)

31. Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný • Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů • Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům

32. Mechanismus ping-pongový • Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt • Substrát předá nějakou skupinu  enzym se uvolní v pozměněné formě • Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu • Poté uvolnění produktu a obnova enzymu • Transferasy