Activación del ciclo celular asociada a muerte neuronal iniciada por daño al DNA.

1. Activación del ciclo celular asociada a muerte neuronaliniciada por daño al DNA. SEMINARIO 4

2. CÉLULAS EN PROLIFERACION: Daño al DNA RELACIÓN Regulación del Ciclo celular Apoptosis

3. Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas • Neuronas asociadas a activación del Ciclo celular • Expresión de proteínas relacionadas con el CC. • Inhibición de esas proteínas tenía efectos neuroprotectores. • Indices mitóticos elevados Enfermedades neurodegenerativas Tanto in vivo como in vitro las neuronas comprometidas a la muerte celular. Capacidad de replicar su DNA. APOPTOSIS DAÑO DNA

4. Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas Mayor sensibilidad DAÑO DNA Deficiencia en la reparación de DNA

5. Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas Daño al DNA RELACIÓN ?? Regulación del Ciclo celular Apoptosis

6. HIPOTESIS: La activación del ciclo celular, es un componente importante de la respuesta al daño de DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas APOPTOSIS Reentrada alCC Agentes genotoxicos

7. HIPOTESIS: La activación del ciclo celular, es un componente importante de la respuesta al daño de DNA, en neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas APOPTOSIS Reentrada alCC Agentes NO genotoxicos

8. Cultivos de corteza cerebral de embriones de rata en dia 18: > 99 % de las cëlulas expresaban MAP 2 ( especifica de neuronas) y GFAP ( celulas de la glia): • CITOMETRIA DE FLUJO

9. Tiempo de cultivo entre 4 y 8 dias: % de celulas en fase S disminuia al 3 % ( neuroblastos)

10. EtoposidoHomocisteinaPeptido β amiloideMetrotexate AGENTESGENOTOXICOS EstaurosporinaColchicina AGENTES NOGENOTOXICOS

11. HIPÓTESIS 1 DAÑO EN EL DNA INDUCE LA PRODUCCION Y ACTIVACION DEL SUPRESOR TUMORAL PROTEINA p53 EN MUCHOS TIPOS CELULARES, INCLUIDAS LAS NEURONAS.

12. PROTEINA p53 : es el producto de un gen supresor tumoral que cumple un rol crítico en la respuesta celular al daño del ADN , previniendo así la perpetuación de las mutaciones u otras anomalías cromosómicas en las células hijas. • Sus funciones incluyen: •SENSAR EL ADN DAÑADO •CONTROLAR LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR Y LA APOPTOSIS •PARTICIPAR EN LA REPARACIÓN DEL ADN.

13. El daño al ADN aumenta la capacidad de p53 de activar genes específicos que ayudan a la célula a superar el daño. Además p53 estimula la producción de enzimas que intervienen en la reparación. • El ciclo se detiene en G1 y G2 hasta que se repara el daño. Si éste es muy extenso, p53 activa la expresión de genes que conducen a la APOPTOSIS.

14. HIPÓTESIS 2 DAÑO EN EL ADN ACTIVA EL CICLO CELULAR EN NEURONAS, EVIDENCIANDO UN AUMENTO EN LA EXPRESION DE Cdc25A.

15. Cdc 25A es un bien establecido regulador de la progresión G1-S y marcador de entrada en fase S , a través de su interacción con el sistema ciclina-CDK. • Pertenece a la familia de fosfatasas que incluyen 3 homólogos en mamíferos: Cdc25A, B y C . Se expresa en la fase media de G1 e induce la entrada en S.

16. EXPRESIÓN de p53 y Cdc 25A en neuronas tratadas con agentes genotóxicos versus no genotóxicos • Expresion de p53 y Cdc25A luego de 14hs de tratamiento con Hom, Aβ, Sts. • P53 • Cdc25A • Colocalización

17. RESULTADO: FUERTE EXPRESIÓN de p53 y Cdc25A en neuronas corticales expuestas a HOMOCISTEÍNA y Aβ PERO NO A STAUROSPORINA.

18. Se confirmó el aumento de expresión por inmunoblot • Se lisaron las células. Las proteínas fueron separadas por tamaños por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. • La membrana se incubó con Anticuerpos primarios contra fosfo-p53 , Cdc25A o Actina. • Las membranas fueron expuestas a un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa . Se visualizaron bandas inmunorreactivas por quimioluminiscencia. • Se hizo un análisis densitométrico de los blots y se expreso la intensidad de la señal corregida contra los blots de actina como proporción de la señal de control.

19. Se confirmó el aumento de expresión dep53 yCdc25A por INMUNOBLOT INMUNOBLOT MOSTRANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE p53 y Cdc25A 1-Control. 2-St a las 7 hs. 3-Hom a las 7 hs. 4-Aβ a las 7 hs. 5-St a las 18 hs. 6- Hom a las 18 hs. 7- Aβ a las 18hs.

20. Conclusion LA EXPRESIÓN DE p53 Y Cdc25A EN NEURONAS CORTICALES LUEGO DE LA EXPOSICIÓN A HOMOCISTEÍNA Y Aβ REFLEJA LA RESPUESTA DE LAS NEURONAS AL DAÑO DEL ADN Y LA ACTIVACIÓN DEL CICLO CELULAR RESPECTIVAMENTE

21. Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S) Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a:

22. Citometría de Flujo Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula. Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente. Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.

23. Fluorocromo: Propidium iodide (PI) • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena. • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa. • Trabajar con células muertas y fijadas. • Excitación en el azul/verde-rojo. Tinción con PI 10 μg/ml 30 min. en oscuridad Fijado RNAasa (100 μg/ml) Citometría de flujo

24. Ciclo Celular 4n 2n

25. Perfiles típicos de distribución del ciclo celular en neuronas corticales de ratones en cultivos Control, con Etopósido y con Staurosporina

26. Incremento significativo de neuronas en fase S luego del tratamiento con Metotrexato, Homocisteína y Etopósido. Con Staurosporina y Colchicina los valores fueron menores que el control.

27. Conclusiones • Los agentes genotóxicos inducen Replicación del DNA en neuronas postmitóticas. • Los agentes apoptóticos no genotóxicos no inducen esta reentrada al ciclo celular. • Se vió que la supresión de las cdks produce un efecto neuroprotectivo posiblemente por perturbación de la respuesta al daño al DNA y la apoptosis neuronal asociada.

28. Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S) Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a:

29. Citometría de Flujo Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula. Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente. Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.

30. Fluorocromo: Propidium iodide (PI) • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena. • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa. • Trabajar con células muertas y fijadas. • Excitación en el azul/verde-rojo. Fijado RNAasa (100 μg/ml) Tinción con PI 10 μg/ml 30 min. en oscuridad Citometría de flujo

31. EXPERIMENTO Nº2 OBJETIVO: Relacionar la inducción a la progresión del ciclo celular con el daño en el ADN y la muerte celular MATERIALES Y MÉTODOS: Cultivos de células neuronales corticales entre el día 4 y 8 Agentes genotóxicos: Etoposido, homocisteína, metotrexato, Aβ1-42 Agentes no genotóxicos: colchicina, estaurosporina Comet assay: cuantificación del daño del ADN Tinción de Hoechst: cuantificación de la apoptosis

35. RESULTADOS

36. CONCLUSIONES AGENTES GENOTÓXICOS Homocisteína Metotrexato Aβ1-42 Etoposido AGENTES NO GENOTOXICOS Colchicina Estaurosporina Daño al ADN Apoptosis No daño al ADN Apoptosis

37. CURVAS CINÉTICAS DE LOS AGENTES UTILIZADOS A- etoposido 1μM B-Estaurosprina 2μM C-Colchicina 0.5μ

38. En que momento del ciclo ocurre la apoptosis? • Cultivo de neuronas • Exposición al agente en presencia de BrdU • Cosecha • Fijación en etanol 70% • Tinción multicolor

39. Replicación Exposición a luz UV +Ac antiBRdU-PHOENIXRED Apoptosis TUNEL: TdT+ BrdUTP-FLUORESCEÍNA Cuantificación simultánea de apoptosis y replicación Estrategias experimentales

40. Cuantificación de apoptosis y replicaciónResultados de la citometría de flujo Porcentaje significativo de replicación ligada a apoptosis Porcentaje no significativo

41. La citometría de flujo provee una estimación cuantitativa del DNA en cada neurona, demostrando una transición de G1 a S en respuesta al daño por genotóxicos. En estos casos la reentrada al ciclo celular y la replicación serían un mecanismo crítico que conducirían a la apoptosis.

42. Objetivos • Definir la cascada involucrado en respuesta al daño de DNA en neuronas postmitoticas que resulta en la reentrada al CC. • Evaluar el % de neuronas apoptoticas, % de neuronas en fase S y daño de DNA en presencia de ATM inhibido y ante la intervencion con distintos agentes que dañan DNA .

43. ATM • ATM: Proteína del grupo proteinkinasas PIK3. • Las PI3K es una serie de proteínas identificadas en varios organismos, las cuales se encuentran involucradas en diferentes checkpoints de la progresión del ciclo celular, respuesta al daño de DNA, en procesos de recombinación y mantenimiento de la estabilidad del genoma.

44. El daño de DNA activa a la proteinquinasa ATM, que fosforila a Chk2, para estimular asi su actividad quinasa • La Chk2 activada fosforila a la fosfatasa Cdc25A y la marca para su poliubiquitinización. • ATM fosforila a p53 en un sitio que interfiere con su union a Mdm2, aumentando su capacidad de activar la transcripción de genes que permitan reparar el daño de DNA ( entre otros p21)

45. La supresión de la función de ATM en cultivos de neuronas corticales previene la apoptopsis y activación del ciclo celular inducida por etopósido?

46. La supresion de la función de ATMimpide la reentrada en el CC inducida por etopósido?

47. Se sugiere un rol clave de la vía ATM-Chkd2 en el control en respuesta al daño de DNA, conduciendo a la activación del ciclo celular y apoptosis en neuronas postmitóticas. • La inhibición de la función de ATM, tiene un efecto prtector de la apoptosis inducida por etoposido, no siendo asi para staurosporina.

48. Objetivo • Evaluar el % de neuronas apoptóticas ante la intervención con Etop Aß y Sts en ratones KO para ATM con respecto a ratones WT.

49. Ratones knockout Genotipificación por metodología de PCR

50. La apoptosis inducida por etoposido o Aß en cultivo de neuronas de ratones KO para neuronas fue significativamente menor comparada con los cultivos de ratones WT. No existieron diferencias en la apoptosis entre los ratones WT y KO ante la intervención con Sts.