1 / 22

11. VAJA:

11. VAJA:. METODE ZA IZOLACIJO IN LOČEVANJE PROTEINOV. HOMOGENIZACIJA: Proces, s katerim razbijemo celične stene in celične membrane (celični organeli ostanejo intaktni). Rezultat je homogenat ali tkivna kaša . Ločiti od:

barclay-sykes
Download Presentation

11. VAJA:

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 11. VAJA: METODE ZA IZOLACIJO IN LOČEVANJE PROTEINOV

  2. HOMOGENIZACIJA: • Proces, s katerim razbijemo celične stene in celične membrane (celični organeli ostanejo intaktni). • Rezultat je homogenat ali tkivna kaša. • Ločiti od: DEZINTEGRACIJA– popolno razbitje vseh celičnih struktur, vključno z organeli; DISPERZIJA – ločitev tkiva na bolj ali manj intaktne celice. Uspešni, če je: • izkoristek čim večji, • kontaminacija z neželjenimi snovmi čim manjša, • struktura iskane snovi nespremenjena.

  3. HOMOGENIZACIJA: • Fizikalne tehnike homogenizacije: • v terilnici (dodatek kremenčevega peska, steklenih kroglic); • s spremembo pritiska (francoska preša); zzamrzovanjem; osmotskim šokom; • z ultrazvokom; • z mešalci (warring blendor, Elvejham-Potterjev homogenizator). • Kemični način: • avtoliza; • različni encimi (lizocim, celulaze, pektinaze, fosfolipaze); • detergenti.

  4. OPTIMALNI POGOJI: • čim krajši čas izolacije; • delamo pri nizkih temperaturah; • pazimo na ionsko sestavo (izotoničnost): • dodatek elektrolitov (NaCl, KCl) • dodatek sladkorjev (saharoza, manitol, sorbitol); • pazimo na ustrezen pH (pufri); • dodatek oksidantov/reducentov; • izboljšamo topnost (glicerol, etilenglikol, detergenti); • encime inaktiviramo: • odstranimo dvovalentne katione (Ca2+, Mg2+, Cu2+) z dodatkom kompleksalov (EDTA, citronska kislina), • z dodatkom inhibitorjev, • denaturiramo s povišanjem T.

  5. RAZTAPLJANJE IN OBARJANJE: Frakcionirano obarjanje: sprememba topnosti. Razrede beljakovin obarjamo tako, da povečujemo količino obarjalnega sredstva. Oborjene beljakovine odstranimo s CENTRIFUGIRANJEM. Vpliv na topnost beljakovin: • ionska jakost elektrolitov, • pH, • dielektrična konstanta, • temperatura.

  6. CENTRIFUGIRANJE:metoda, ki temelji na različnem usedanju delcev v polju centrifugalne sile. Hitrost usedanja (sedimentacije) posameznega delca je odvisna od: • radialnega pospeška ar = ω2r (ω-kotna hitrost, r- polmer rotorja); • gostote (d) in velikosti (polmer rd) delca; • gostote (m)in viskoznosti (η) medija. Čas sedimentacije sferičnih delcev izračunamo: r1 - radialna razdalja od osi do položaja delca ob ts = 0 r2 - radialna razdalja od osi do položaja delca ob ts

  7. CENTRIFUGIRANJE:  • Preparativno centrifugiranje: • diferencialno centrifugiranje, • gradientno centrifugiranje. • Analitsko centrifugiranje supernatant sediment

  8. DIALIZA IN ULTRAFILTRACIJA: 1. Dializa: raztopini ločimo s polprepustno membrano dializni dializat preostanek • Ultrafiltracija: nadtlak potisnega plina ali centrifugalna sila ultrafiltratfiltrirni preostanek (retentat)

  9. ELEKTROMAGNETNI SPEKTER

  10. ABSORPCIJSKASPEKTROMETRIJA: • Absorpcija svetlobe vzbujeno stanje: M + h = M*

  11. Absorpcija UV (180–340 nm) ali vidne svetlobe (340–800 nm)

  12. Beerov-Lambert-ov zakon: A = ε∙l∙c

  13. SPEKTROFOTOMETER

  14. UPORABA: • merjenje koncentracije snovi, • kvalitativna analiza snovi, • zasledovanje kemijskih reakcij, • raziskave strukture DNA, • študije lastnosti proteinov in vezave majhnih molekul nanje.

  15. IZOLACIJA BELJAKOVIN Z OBARJANJEM • Izolacija Ig iz seruma (goveji, konjski, svinjski, ovčji): 4 mL seruma + 2 mL nasičene razt. amonsulfata (NAS) (= 33 % nasičenje z (NH4)2SO4)) Obarjanje Ig 30 min na ledu z občasnim mešanjem Centrifugiranje 15 min na 3000 g, 4 oC (ločevanje oborine od supernatanta) Supernatant Oborina (sediment) (serumske beljak. (protitelesa – Ig) brez protiteles) raztopimo v 1,5 mL PBS (pH 7,2)

  16. KVANTITATIVNO DOKAZOVANJE BELJAKOVIN • Vzorci za kvantitativno določanje beljakovin: • Slepa proba (2×) • Serum • Protitelesa, izolirana iz seruma z obarjanjem (33% NAS) • MERJENJE ABSORPCIJE PRI 280 nm: • Vzorcu (redčen 1:100!) izmeri absorpcijo pri 280 nm • Predpostavi, da je ε = 1 mL/mgcm za serum, oz. ε = 1,4 mL/mgcm za protitelesa in IZRAČUNAJ koncentracijo proteinov v vzorcu (l = 1 cm) po Beer – Lambert -ovem zakonu!

  17. BIURETSKA REAKCIJA: • Naredi umeritveno krivuljo s standardnimi koncentracijami proteinskih raztopin: • Vzorec (serum ali Ig) redčen 1:10 • Slepa proba:2 mL PBS pufra + 3 mL biuretskega reagenta

  18. - x mL PBS pufra • Standardne proteinske raztopine za biuretsko reakcijo: (osnovna raztopina BSA: γ = 10 mg/mL) - x mL raztopine BSA 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 mg/mL • K 2 mL vzorca dodaj 3 mL biuretskega reagenta. • Inkubiraj 10 minut pri 37°C. • Izmeri absorpcijo pri 540 nm in nariši umeritveno krivuljo!

  19. BIURETSKA REAKCIJA: γ = γ =

  20. DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV Z Bio-Radovim reagentom: • Naredi umeritveno krivuljo s standardnimi koncentracijami proteinskih raztopin: • Vzorec (serum ali Ig) redčen 1:100 • Slepa proba:100 μL PBS pufra + 5 mL Bio-Radovega reagenta

  21. - x mL PBS pufra • Standardne proteinske raztopine za Bio-Rad reakcijo: (osnovna raztopina BSA: c = 1 mg/mL) - x mL raztopine BSA 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 mg/mL • K 100 L vzorca dodaj 5 mL Bio-Radovega reagenta (redčenega 1 + 4). • Inkubiraj 10 minut na RT. • Izmeri absorpcijo pri 595 nm in nariši umeritveno krivuljo!

  22. BIO-RADOV REAGENT: γ = γ =

More Related