MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D.

1. Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno Brno 2003

2. Genomika – studium genomu 1. Strukturální - identifikace genů - umístění genu na chromozomu (fyzické mapování) - stanovení nukleotidové sekvence genu 2. Komparativní - mezidruhové srovnávání, evoluční studie 3. Funkční (RNA genomika) - genová exprese (jak geny fungují) 4. Farmakogenomika - využití genetiky při vývoji vakcín Proteomika– studium proteinů

3. Využití metod molekulární biologie • Teorie • objev nových genů a proteinů • zkoumání mechanismu regulace eukaryontních genů • studium funkce proteinů • poznání evoluční historie eukar. genu (fylogenetické mapy) • Praxe • diagnostika původců infekčních onemocnění • diagnostika genetických chorob (mutace v DNA), léčba • farmaceutický průmysl – léky (př. inzulín pro diabetiky) • potravinářství (identifikace přídavků do potravin) • genové inženýrství (geneticky modifikované organismy) • soudní lékařství - kriminalistika(identifikace osob) • - testování paternity a maternity • testování identity jedinců vzácných zvířat • ověřování rodokmenů zvířat

4. Metody molekulární biologie Izolace DNA • Materiál • tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny) • tkáně (vlasy, orgány) • organismy (bakterie, viry, kvasinky, paraziti, rostliny, hmyz) • čerstvý/zmrazený/parafinovaný materiál • Postup • komerční kity (enzym - proteáza, pufry, kolonky), izolace 20 min • fenol chloroformová extrakce  

5. Metody molekulární biologie - klonování 1. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého úseku DNA v přístroji „termocycler“ (K.Mullis, 1983) • Do reakce se dává • testovaná DNA • synteticky připravené primery (krátké úseky DNA) • nukleotidy ve formě trifosfátů (ATP, TTP, CTP, GTP) • enzym Taq polymeráza (z bakterie Thermus aquaticus) • pufr obsahující Mg2+ ionty • Fáze PCR • denaturace DNA • annealing – nasednutí primerů na komplementární úsek DNA • extension – napojování nukleotidů

6. Polymerázová řetězová reakce (PCR) 1 cyklus PCR 94 – 95oC 72oC 50 - 60oC extension annealing denaturace Při 30 cyklech- amplifikacevíce než 109kopií úseku DNA

7. Polymerázová řetězová reakce (PCR) • Typy PCR • Jednoduchá PCR • Nested, semi-nested PCR • Koamplifikační, multiplexová (comultiplex, multiplex PCR) • Reversní transkripční PCR (RT-PCR) • Semikvantitativní, kvantitativníPCR • - Komparativní (Q-PCR) • - Kompetitivní (QC-PCR) • - PCR v reálném čase (Real-time Q-PCR)

8. Metody molekulární biologie - klonování 2. Namnožení úseku DNA v bakteriích • Plazmidový klonovací vektor • - malá kruhová molekula DNA (plazmid bakterie E.coli) • musí obsahovat replikační počátek • musí mít místo pro restrikční endonukleázu • musí mít gen pro rozlišitelnou vlastnost (rezistence k antibiotikům) • Postup • rozštěpení vektoru restrikční endonukleázou • začlenění fragmentu DNA do vektoru DNA-ligázou (enzym) • začlenění plazmidu s fragmentem DNA do bakterie • po namnožení bakterie, lýza bakterii a uvolnění plazmidů • vyštěpení fragmentu DNA z plazmidů restrikční endonukleázou

9. Genomová knihovna (chromozomální DNA) Genomová knihovna Lidská DNA Fragmenty genomové DNA Rekombinantní DNA Inzerce DNA-fragmentů do plasmidů Vnesení plasmidů do bakterií Rozštěpení DNA restrikční endonukleázou

10. cDNA knihovna (komplementární DNA) • - lýza buněk tkáně a izolace mRNA • pomoci enzymu reverzní transkriptáza přepis do sekvence DNA • (cDNA= complementary, komplementární DNA) • naklonování molekul cDNA do plazmidových vektorů Výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů !!!

11. Metody molekulární biologie Gelová elektroforéza Princip Oddělení fragmentů DNA podle velikosti • Postup • příprava gelu– agarózový, polyakrylamidový gel • obarvení vzorku – ethidium bromid, bromfenolova modř • nanesení vzorku na gel - nastavení napětí a doby elektroforézy • zviditelnění fragmentů DNA - UV transluminátor

12. Příklad výsledku gelové elektroforézy 1-7: pozitivní výsledek - amniové tekutiny gravidních žen (362 bp sekvence) 8: negativní kontrola 9: pozitivní kontrola (362 bp sekvence T. gondii) 10: 50 bp velikostní standart (ladder)

13. Metody molekulární biologie PCR/RFLP restriction fragment length polymorphism • Fáze • amplifikace specifického úseku DNA pomoci PCR • štěpení enzymem „restrikční endonukleáza“ při 37oC 1h • analýza štěpných fragmetů DNA na agarózovém gelu místo štěpení 5´ HaeIII 3´

14. RFLP • Restrikční mapy • - fyzická mapa štěpných míst v DNA • studium polymorfismu mezi druhy, v rámci druhu mezi kmeny, skupinami (fingerprinting) • př. alfa-globinový gen (studium příbuznosti Ho a ostatních primátů) Přehodnocování systematického zařazení jednotlivých organismů

15. Metody molekulární biologie Southern blotting Princip: přenos DNA (jednořetězcové) z gelu na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu na přístroji „vacuum blotter“ • Postup: • štěpení DNA restrikční endonukleázou • elektroforéza • depurinace DNA v HCl, denaturace DNA v NaOH • Southern blotting (blotování) - pod vakuem 90 min. • (3 vrstvy filtračního papíru, nylonová membrána, gumový rám, • gel s DNA) - kapilární

16. Metody molekulární biologie Hybridizace Princip: Hybridizace = renaturace (proces obnovení vodíkových můstků mezi komplementárními bázemi), pomoci DNA sond se vyhledávají specifické nukleotidové sekvence. DNA sonda: krátká jednořetězcová DNA (10-1000 nukleotidů), značena - radioaktivně (izotop 32P) - neradioaktivně (chemiluminiscence) • Postup: • uzavření membrány do plastikového sáčku spolu se značenou sondou • hybridizace (navázání sondy na komplementární úseky DNA) • vymytí membrány (odstranění nenavázané sondy) • detekce - autoradigrafie • - detekční látky (hydrogen peroxid a luminol) – fotograf.film

17. Metody molekulární biologie Elektroforéza, Southern blotting a hybridizace neznačená rozštěpená DNA nitrocel. papír nitrocelul. papír s DNA agarózový gel mycí houba alkalický roztok Elektroforéza Souhthern blotting Hybridizace sonda autoradiograf

18. Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování) • Enzymová metoda • Použití přístroje „sekvenátor“ Genová banka NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Kompletní genom(údaje ke konci roku 2003) Eukaryota: 20(Avena sativa, Glycine max, Hordeum vulgare, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Anopheles gambiae, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi, Guillardia theta, Sacharomyces cerevisiae, Plasmodium falciparum, Schizosacharomyces pombe) Prokaryota: 17 (archebakterie), 128 (bakterie) Viry: 1656

19. Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)

20. Genové inženýrství • Využití: • Výroba buněčných proteinů ve velkém množství (insulin, růstový hormon, plášťové proteiny virů pro očkování….) • Syntéza velkého množství RNA (studium proteosyntézy) • Genová terapie • Výzkum nových genů Transgenní organismy – ve svém genomu obsahují nové geny, nebo geny pozměněné metodami rekombinantní DNA Klonování zvířat – 1996 (ovce), 1998 (skot, myš, koza), 2000 (prase, muflon), 2001 (kočka, divoký tur gaur), 2002 (králík), 2003 (mula, divoký tur banteng) (zdroj časopis 21. století/ 8. číslo, www.osel.cz)