Genetica del cancro

1. Genetica del cancro Lezione 12 By NA

2. Il tumore come network Carcinoma del colon Cancro invasivo Le cellule divengono invasive e metastatizzano Le cellule mutate iniziano a duplicarsi in modo incontrollato Displasia. Le cellule perdono morfologia Processo di vascolarizzazione Iperplasia Le cellule conservano morfologia Cancro in situ Le cellule perdono il contatto con il tessuto Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno By NA

3. Un punto di vista diverso La selezione agisce attraverso la fitness di un gruppo di individui: chi si riproduce di piu’ per effetto di mutazioni favorevoli in quel momento e in quel luogo prendera’ il sopravvento trasferiamo questo concetto ad un gruppo di cellule : una cellula muta, acquisisce un vantaggio proliferativo sfuggendo anche parzialmente al sistema di controllo, si riprodurra’ piu’ rapidamente la cellula nell’organismo e’ sottoposta ad un controllo a molti livelli e difficilmente potra’ in breve tempo prendere il sopravvento…… almeno finche’ i sistemi di controllo sono efficienti By NA

4. Due forze contrastanti Una spinge la cellula mutata a prendere il sopravvento e l’altra protegge l’organismo nel suo insieme (apoptosi, meccanismi di riparo) questo fa si che almeno fino al momento in cui un organismo si riproduce il numero di mutazioni somatiche che si accumulano nella cellula non raggiungano il livello di guardia: si pensa 6-7 (con le dovute eccezioni), e soprattutto con la nuova generazione si rincomincia. con il tempo i meccanismi di controllo si attenuano e vengono meno……… By NA

5. e allora come mai il cancro? se la possibilita’ di accumulare in una cellula o in un suo clone e’ bassa come mai ci sono i tumori cosidetti maligni? sostanzialmente ci sono due meccanismi che permettono la progessione: • mutazioni che aumentano la capacita’ proliferativa incrementando il numero di “individui” in cui potrebee manifestarsi una seconda, terza …… mutazione • mutazioni che intaccano la stabilita’ del genoma aumentando il livello di mutazioni nel loro insieme By NA

6. riarrangiamenti multipli By NA

7. riarrangiamenti multipli By NA

8. percorsi che portano alla cancerogenesi possiamo ridurre a due i percorsi che sviando, portano al tumore: percorsi che controllano la nascita di nuove cellule (geni del ciclo cellulare) e percorsi che portano alla morte (geni che controllano l’apoptosi) al primo percorso appartengono quei geni (protoncogeni) che nella forma wt promuovono la proliferazione. Quando l’effetto della mutazione provoca un ”gain of function” il risultato e’ un prodotto inappropriato nella sua attivita’ o nello spazio o nel tempo.Vista la loro funzione wt basta la mutazione di un allele vi ricordo che non e’ la mutazione in se’, ma l’effetto che la mutazione ha sulla funzione. il cancro e’ un fenotipo come gli altri, viene meno una funzione dell’individuo cellula. By NA

9. percorsi che portano alla cancerogenesi al secondo appartengono quei geni che nella versione wt impediscono la progressione del ciclo cellulare (definiti TS tumor suppressor), stimolano l’apoptosi , controllano la stabilita’ del genoma, garantiscono l’accuratezza della replicazione, del riparo e della segregazione. Il fenotipo mutante compare quando tutti e due gli alleli sono mutati nella stessa cellula. Il nostro organismo e’ come un auto in cui i protooncogeni sono l’accelleratore e i TS i freni. By NA

10. Oncogeni Era noto che alcuni tumori animali originassero da infezioni virali, questa informazione derivava da esperimenti in vivo ed in vitro. Nell’uomo sono pochi quelli dimostrati ad eziologia esogena By NA

11. Oncogeni Quello che ci interessa e’ che geni portati da virus possono trasformre le cellule ospite. lo studio di questi geni ha permesso di capire cosa sono gli oncogeni. Test in vitro come il NIH-3T3 hanno permesso di chiarire che in tumori di origine non virale sono presenti oncogeni endogeni attivati By NA

12. Oncogeni Il primo oncogene virale identificato (1983) e’ stato v-sis che corrisponde al gene PDGFB fattore di crescita delle piastrine. La sua espressione incontrollata e’ concordante con l’idea che l’eccesso di un grow factor porti ad un’iperproliferazione. L’analisi di altri oncogeni ha confermato che la loro funzione e’ indispensabile per la cellula e che la loro alterata espressione e’ all’origine dei tumori. • Grossolanamente possiamo suddividere gli oncogeni in 5 classi: • fattori di crescita secreti • recettori di membrana • componenti dei sistemi di trasduzione del segnale intracellulare • proteine DNA-binding compresi i fattori di trascrizione • componenti del network delle cicline, delle chinasi-ciclino dipendenti e degli inibitori delle kinasi. Tutti componenti che controllano il normale svolgimento del ciclo cellulare By NA

13. Oncogeni By NA

14. Attivazione protoncogeni Un protoncogene diventa oncogene quando la mutazione provoca un aumento di funzione che puo’ essere : • quantitativo di un prodotto normale • qualitativo: prodotto leggermente mutato che non puo’ rispondere al suo controllore, prodotto chimerico originato da un riarrangiamento genomico Le mutazioni sono sempre somatiche, ci sono alcune eccezioni, ma la predisposizione alla comparsa di tumori e’ un aspetto di sindromi polimalformative a trasmissione auosomica dominante (RAS) Anche il protoncogene RET e’ particolare: le sue mutazioni con attivazione provocano la MEN2A neoplasia delle ghiandole endocrine che si puo’ presentare come familiare. Si ritiene che questo comportamento derivi dalla ristrettezza dell’espressione del prodotto mutato di RET nello spazio e nel tempo. Da notare che mutazioni con perdita di funzione di questo gene provocano una sindrome neonatale:Morbo di Hirschprung. Anche il protoncogene KIT mutato con perdita di funzione provoca una sindrome familiare con depigmentazione il piebaldismo. By NA

15. Attivazione protoncogeni double minutes Amplificazione genica conseguenza di errori casuali nella replicazione del DNA Esempio: cromosomi double minutes e homogeneously staining regions (HSR) By NA

16. Attivazione protoncogeni Mutazione puntiforme • Esempio: nel carcinoma della vescica, il gene ras presentauna mutazione nella sostituzione di una singola base che, a sua volta, provoca la sostituzione di un amminoacido. Tali cambiamenti avvengono in punti caratteristici del gene che conducono a trasformazione cellulare By NA

17. Attivazione protoncogeni gene catena pesante Ig c-myc Riarrangiamento cromosomico:linfoma di Burkitt t(8;14) traslocazione • c-myc si viene a trovare sotto il controllo del promotore del Ig che e’ un promotore forte e nella serie bianca funziona ad un ritmo elevato: il proto-oncogene perde la propria regolazione e assume quella del Ig. La cellula perde il controllo • QUESTO AVVIENE SOLO SE LA TRASLOCAZIONE SI VERIFICA NEI LINFOCITI! By NA

18. Attivazione protoncogeni ABL ABL/BCR BCR/ABL BCR Nel 95% dei casi di CML cromosoma non normale chr Philadelphia (1961) Indagini FISH E MOLECOLARI Traslocazione reciproca braccio lungo chr.9 e il braccio lungo chr.22: t(9;22)(q34;q11). CML, Leucemia Mieloide Cronica • SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE: • ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta) • BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare) By NA

19. Attivazione protoncogeni By NA

20. Attivazione protoncogeni By NA

21. Modalita’ di espressione Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche? • Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi • gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse) • Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della cellula non dell’individuo! Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismo ci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allele wild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne pregiudica la funzione. By NA

22. Oncosoppressori gatekeepers Questi oncosoppressori vengono definiti “gatekeepers”: (guardiani) perche’ regolano funzioni cellulari fondamentali come l’innesco della proliferazione, del differenziamento e dell’apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA. • APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata funzionalita’ di un allele non provoca la comparsa del fenotipo, ma mette la cellula in condizioni di “debolezza”. La cellula e’ eterozigote e il gene puo’ ancora svolgere la funzione, ma e’ una funzione non completamente efficace By NA

23. Oncosoppressori gatekeepersesempi • La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita’ di ras. • APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo, che porta all’espressione di c-MYC • La perdita di p53 genera la sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo le cellule al processo di apoptosi By NA

24. Altri oncosoppressori By NA

25. Perdita di eterozigosita’ LOH famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D Cellule tumorali omozigote eterozigote eterozigote LOH By NA

26. Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione + Rb -- + + x Rb Rb + + Rb Rb Rb Rb + Rb Rb Rb mutazione puntiforme C.O mitotico Non disgiunzione e duplicazione delezione Conversione genica Rb By NA

27. Perdita di eterozigosi per identifiare un TS By NA

28. Perdita di eterozigosi / instabilita’ By NA

29. come funzionano i TS By NA

30. controllo dell’integrita’del genoma By NA

31. Carney Complex (CNC)de novo Diagnosi clinica: 19 anni, lieve ritardo mentale, difficolta’ di apprendimento, iperpigmentazione, mixomi al seno e all’ipofisi By NA

32. Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro Mixoma: tumore benigno connettivale quando localizzato nel cuore puo’ provocare alterazioni cardiache By NA

33. Carney Complex (CNC) disease:autosomico dominante, suscettibilita’ al cancro PRKAR1A(17q24): gene codificante l’unita’ regolatoria della proteinchinasi A.L’80% degli affetti ha mutazioni in questa sequenza La paziente non ha mutazioni nel gene By NA

34. Cariotipo A 10 anni era stato eseguito il cariotipo per il ritardo mentale: presenza di un piccolo marcatore de novo non identificato nel 70% delle metafasi By NA

35. 2009: array-CGH alla comparsa del fenotipo del Carney Complex e’ stata eseguita un array-CGH per chiarire se ci fosse relazione con il piccolo marcatore chr1:83061240-84663025 1.6 Mb Log2ratio 1.08 (triplicatione) By NA

36. FISH FISH with probe(s) of the unbalanced region confirmed that the triplicated material is located on the marker chromosome La FISH con i BAC della regione triplicata conferma l’origine del piccolo marcatore sovrannumerario e lo sbilanciamento genomico By NA

37. Domanda Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e Carney Complex disease della proposita? By NA

38. Domanda Il materiale genomico presente nel marker e’ reponsabile del fenotipo (ritardo mentale e Carney Complex disease della proposita? Is the genetic material contained within the de novo marker chromosome responsible for the phenotype of the proband(mental retardation, Carney complex disease)?? From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the gene According to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease By NA

39. The genes in the triplication portion not known as disease-gene Sterile alpha motif domain??? urate oxidase urate oxidase Tubulin tyrosin ligase-like highly expressed in the nervous system cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit From OMIM: urate oxidase is presumably a nonessential enzyme in humans. Lack of this enzyme might contribute to the development of hyperuricemia and gout in adult life No information for increased dosage of the gene According to bioinformatic tools, the marker was not associated with the patient’s phenotype since the only disease-gene is not involved in the development of the Carney complex disease By NA

40. Same effect of PRKAR1A mutation? Triplication of the PRKACB cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit By NA

41. … The net effect of all these changes in CNC cells is an increase in DNA transcription and/or activation of other pathways leading to abnormal growth and proliferation. By NA

42. PKA Activity Real Time PCR on lymphocytes and fibroblasts from the patient and two controls Normalized to actin Normalized to gapdh We know now that the Carney phenotype of our patient is linked to the triplication of the catalytic subunit of the protein kinase A gene By NA

43. Array analysis must be done having in mind the phenotype and not in a blind way Genome-wide array analysis requires noteworthy ability in using public genomic databases a similar case in a prenatal diagnostic setting could have been interpreted as without any clinical consequences since none of the triplicated genes was known to be pathogenic when amplified By NA