UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL-LABIOEX Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT Ms. Karina Bettega Felipe Florianópolis, maio de 2011

2. 1. Princípio

3. 2. Amostra • Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 3. Reagentes/soluções/suspensão celular • Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de antibióticos penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL (1%); • Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL • Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de meio de cultura completo

4. Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL 4. Procedimento • Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL: • a) Retirar o meio de cultura da garrafa

5. b) Lavar a garrafa com PBS c) Adicionar a tripsina

6. d) Esperar a tripsina reagir e) Preparo do meio de inativação

7. f) Inativar a tripsina g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon

8. h) Centrifugar as células i) Retirar meio com tripsina

9. j) Ressuspender as células em meio simples

10. k) Contar as células Nº céls/mL= nº céls contadas/4 x diluição da câmara X diluição amostra Nº céls /mL=nº céls contadas/4 x 104 X 10

11. l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL • 200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL • Contagem de células: 5 X 105 células/mL • Número de células necessárias: • 0,5 X105 células – 1000µl • X - 19200µl • X= 9,6 X105 células • Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células? 5 X105 células – 1000µl 9,6X105 células- X X= 1920µl

12. 5 X105 células – 1000µl 0,5 X105 células - X X= 100µl 100µl (0,5 X105 células) – 1000µl X - 19200µl X= 1920 • Suspensão utilizada para o teste: • Precisaremos de 19.200 1920µl de soro 192µl de antibiótico 1920µl da suspensão celular 15168µl de meio µl

13. Preparo da suspensão celular • Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço

14. 24h Retirar o meio de cultura 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO

15. Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL) 1000µL 1000µL 1000µL 200µL Solução mãe (1000µg/mL) 100µg/mL 1800µL meio 12,5µg/mL 1000µL meio 50µg/mL 1000µL meio 25µg/mL 1000µL meio 1000µL 1000µL 6,25µg/mL 1000µL meio 3,125µg/mL 1000µL meio

16. CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125 CTRL 100 50 25 12,5 6,25 3,125 100 50 25 3,125 CTRL 12,5 6,25

17. 24h Retirar o meio de cultura 24, 48 ou 72 h TRATAMENTO

18. O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT Retirar o meio Lavar os poços 2X com PBS Adicionar DMSO 5’ 2h Estabilização da cor 540 nm 5’

19. Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL) • Preparo da solução estoque a 5mg/mL • Pesar 5mg de MTT • Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril. • b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL) • CV=CV • 5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL • V= 1mL da solução estoque • + 9mL de meio completo 900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio

20. O que vocês vão fazer!!! Preparar solução MTT Retirar o meio Lavar os poços 2X com PBS Adicionar DMSO 5’ 2h Estabilização da cor 5’ 540 nm

21. Cálculos Descontar o branco ! Considerar o controle como 100% de células viáveis e fazer regra de três para determinar a viabilidade celular das amostras Fazer a média da absorbância