Deux méthodes de diagnostic moléculaire des espèces de Melampsora , agents de la rouille foliaire des peupliers

1. Deux méthodes de diagnostic moléculairedes espèces de Melampsora,agents de la rouille foliaire des peupliers INRA Nancy Unité de recherche Pathologie Forestière Claude Husson, Pascal Frey, Jean Pinon

2. moins de 1 000 ha de 1 000 à 2 500 ha de 2 500 à 5 000 ha plus de 5 000 ha Les peupleraies 230 000 ha 1,3% de la surface boisée 2,2 millions m3 par an ( chêne) culture clonale : monoclonale / parcelle pauciclonale / région

3. urédospores urédies Pertes économiques importantes La rouille foliaire des peupliers Agents pathogènes : Melampsora spp. (Basidiomycètes, Urédinales) Dégâts: • défeuillaison intense • réduction de croissance • affaiblissement général

4. M. larici-populina,la plus fréquente et la plus agressive M. allii-populina, présente partout en France M. medusae, parasite de quarantaine, essentiellement dans leSud-Ouest de la France Nord+Est Centre Ouest Sud-Ouest En France, 3 espèces de Melampsora sont pathogènes sur les peupliers cultivés :

5. 1 cm 1 cm 1 mm urédies écidies hôte alternant (mélèze) hôte principal (peuplier) télies • télien • écidien  morphologie très proche entre espèces morphologie distincte entre espèces détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire  • urédien Cycle de la rouille du peuplier Identification des espèces à différents stades de développement :

6. M. larici-populina (30 isolats) M. larici-populina M. allii-populina (28 isolats) 88 isolats étudiés M. allii-populina M. medusae (30 isolats) M. medusae M. medusae Origine géographique des isolats étudiés

7. Région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l’ADN ribosomal I - Analyse de la formation d’hétéroduplex M. larici-populina M. allii-populina M. medusae II - Trois couples d’amorces spécifiques des espèces : 100 pb 5,8S ITS2 25S 17S ITS1 ITS4-MLP ITS4-MAP ITS4-MM ITS1-MLP ITS1-MM ITS1 ITS4 ITS1-MAP Les deux outils de biologie moléculaire utilisés

8. Espèce à déterminer ITS amplifiés (amorces ITS1 / ITS4) 3 ITS de référence M. medusae M. larici-populina M. allii-populina dénaturation à 94°C renaturation jusqu’à 25°C homoduplex et hétéroduplex homoduplex et hétéroduplex I - Analyse par formation d’hétéroduplex :PRINCIPE homoduplex

9. Révélation sur gel d’acrylamide à 8% M : marqueur de taille (100 pb) MLP : M. larici-populina MAP : M. allii-populina MM : M. medusae MLP + MM MAP + MAP MLP + MAP MLP + MLP MM + MM MAP + MM M hétéroduplex  700 pb Révélation sur gel d’agarose à 1% MLP + MM MAP + MAP MLP + MAP MLP + MLP MM + MM MAP + MM M hétéroduplex  homoduplex I - Analyse par formation d’hétéroduplex : MISE EN EVIDENCE homoduplex

10. CONCLUSIONS : • méthode moléculaire simple et fiable pour l’identification des espèces I - Analyse par formation d’hétéroduplex RESULTATS : Confrontations des ITS amplifiés des urédospores des 88 isolats avec les 3 ITS de référence • Formation d’hétéroduplex dans 100% des confrontations interspécifiques (ITS hétérologues) •  Absence d’hétéroduplex dans 100% des confrontations intraspécifiques • (ITS homologues) • gel d’agarose bien adapté au diagnostic interspécifique en routine • méthode indirecte d’analyse du polymorphisme de séquence • pourcentage d’homologie intraspécifique des ITS supérieur à 95%

11. M. larici- populina M. allii- populina M. medusae ITS1-MLP / ITS4-MLP Validation sur l’ADN d’urédospores de 88 isolats : M 1 8 9 T 4 5 6 7 2 3 • Les couples d’amorces spécifiques d’espèce permettent l’amplification de l’ADN de 100% des isolats de l’espèce correspondante ITS1-MAP / ITS4-MAP La spécificité des amorces est confirmée Outil d’identification des 3 espèces de Melampsora très fiable ITS1-MM / ITS4-MM ITS1 / ITS4 II - Amorces spécifiques d’espèces : RESULTATS ET CONCLUSIONS • Aucune réaction croisée entre ces 3 espèces n’a été observée

12. cas de M. larici-populina : télies sur peuplier écidies sur mélèze II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 1- identification d’une espèce à différents stades du développement • Validation du couple d’amorces sur ces deux stades • Pas de réaction croisée avec l’ADN de l’hôte

13. II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2 - détection d’une espèce rare en mélange avec une espèce majoritaire au stade urédien (peuplier) : cas de M. medusae en mélange avec M. larici-populina • M. medusae - parasite de quarantaine - espèce peu fréquente - répartition géographique mal expliquée : Sud-Ouest de la France • M. larici-populina - espèce très majoritaire en France

14. [ ADN M. medusae ] 600 pb    Détection de M. medusae dans une solution à 0,1 pg / µl 0,5 pg/µl 10 pg/µl 0,1 pg/µl 0,05 pg/µl 1 pg/µl 10 ng/µl 0,1 ng/µl 1 ng/µl T M II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges d’ADN de M. medusae et de M. larici-populina (10 ng/µl) utilisation des amorces spécifiques de M. medusae  Seuil de détection de 1 / 100 000 soit l’équivalent de la quantité d’ADN de 6 urédospores dans le mélange

15. Dilution en cascade Nombre de spores de M. medusae 64000 6400 640 64 6 3 0 600 pb    Détection de 6 urédospores de M. medusae parmi 800 000 urédospores de M. larici-populina II - Amorces spécifiques d’espèces : APPLICATIONS 2- détection d’une espèce rare en mélange dans une espèce majoritaire Mélanges de SPORES de M. medusae et de M. larici-populina (extraction de 2 mg de chaque mélange = 800 000 spores)  Seuil de détection inférieur à 1 / 100 000  Possibilité de détecter une seule urédie de M. medusae sur 100 feuilles de peuplier très infectées par M. larici-populina

16. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Les amorces spécifiques d’espèces ont montré leur efficacité :  pour l’identification de l’espèce quel que soit le stade de développement  identification des espèces sur écidies : efficacité du passage de M. larici-populina sur mélèze  la détection d’une espèce rare (amorces >>>> microscope)  application pour le contrôle du parasite de quarantaine M. medusae, effectué par le LNPV Construction d’amorces spécifiques des 5 espèces de Melampsora des trembles :  certaines ont pour hôte altenant le mélèze  l’identification au microscope est très difficile, même au stade urédien