Cours M1 - 2012

1. Cours M1 - 2012 Introduction aux techniques de biologie moléculaire

2. ADN ARNm Protéine Analyse des protéines Expression des gènes Analyse des ARNm

3. Analyse des interactions protéines/ADN Analyse des interactions protéines/protéines ADN ARNm Protéine Analyse des protéines Expression des gènes Analyse des ARNm

4. Expression des protéines •  Western-blot • Immunoprécipitation • Immunocytochimie • ELISA

5. Expression des protéines Western-blot Principe:  Séparation des protéines selon leur poids moléculaire  Immunodétection de la protéine d’intérêt Étapes:  Extraction et préparation des protéines des échantillons biologiques (dosage de protéine)  Migration et transfert sur membrane  Immunodétection

6. Dosage des protéines: pourquoi ? • Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc… • Conditions différentes: - témoin, • - traitement inducteur ou inhibiteur •  Expression différente de la protéine d’intérêt Uniformisation des échantillons Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de l’échantillon ou le traitement reçu Dosage des protéines

7. Ebullition  dénaturation - + + - H2N COOH + - + Détergent anionique lipophile (SDS)  charges négatives  solvatation + empêche précipitation - + - + - + COOH COOH H2N H2N - - + - - - - + - - - - - - Composant sulfhydryl (β-mercaptoéthanol, DTT)  empêche régénération des ponts disulfures - + - - - - - - - - COOH H2N Solution tampon (Laemmli) Préparation des échantillons Protéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes Contrecarrer ces effets  Différenciation sur 1 seul paramètre Glycérol  augmente densité échantillon • Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse) • Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)

8. Western-blot Immunodétection  Blocage des sites aspécifiques  Incubation avec Anticorps primaires  Incubation avec Anticorps secondaires  Révélation

9. Western-blot X X X X Blocage de la membrane  Blocage des sites aspécifiques: - Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween) - BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween) Blocage avec des protéines inertes Membrane

10. Western-blot Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires X X X X X X X X Membrane Incubation avec Anticorps primaires  Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X  Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA) Membrane

11. Western-blot Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Perox Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires X X X X X X X X Incubation avec Anticorps secondaires  Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)  Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) Membrane

12. Western-blot Perox Perox Perox Perox Hypoxie Normoxie X X X X Ex: Stabilisation du facteur de transcription HIF-1α par l’hypoxie Révélation par chemiluminescence • Ajout du substrat de l’enzyme • Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière • Impression d’un film photographique • Révélation photo

13. Western-blot Western-blot: Résumé  Extraction et préparation des échantillons - Protection vis-à-vis des protéases - Dosage - Dénaturation  Electrophorèse - Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids moléculaire) - Transfert sur membrane  Immunodétection - Blocage des sites aspécifiques - Incubations avec Ac 1aire puis 2aire - Révélation

14. Western-blot Western-blot Immunoprécipitation • Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire • Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt • Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à des anticorps (ex: Protein G) • Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée • Interactions protéines-protéines, protéine-médicament • Concentration d’une protéines présente en faible quantité

15. Immunocytochimie Ex: Mise en évidence du cytosquelette • Anticorps 1aire anti-tubuline • Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine Immunocytochimie • Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique d’immunofluorescence • Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques • Utilisation d’un fluorochrome couplé à: - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

16. Immunocytochimie Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS Anti-actine Perméabilisation au Triton X-100 (0,05%) X X X Analyse au microscope Blocage des sites aspécifiques (BSA 3%) Anticorps 2aire couplé au fluorochrome Lavages au PBS Anticorps 1aire (une nuit – 4°C) Immunocytochimie: Méthode Cellules en culture

17. Immunocytochimie Immunocytochimie: exemple Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor) - Présence O2  cytoplasmique • Absence O2  nucléaire  transcription de gènes nécessaires à la survie cellulaire • Fibroblastes de membrane synoviale humains • + mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h Témoin CoCl2

18. Immunocytochimie Les fluorochromes Exemples DAPI • Excitation à 365 nm; émission à 420 nm • Contre-coloration de fond des noyaux • Fluorescence bleue • FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine • Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm • Fluorescence verte • TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate • Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm • Fluorescence rouge

19. IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO • Méthode d’analyse des cellules in situ dans les tissu • Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques • Utilisation un anti corps secondaire couplé à une enzyme (HRP ou ALP) • Utilisation un anti corps secondaire couplé d’un fluorochrome - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

20. IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO Détection du collagène type deux Révéler par ALP coloration rouge Détection du GFAP Révéler par fluorescence

21. Les differents type de microscopie

22. . ELISA ELISA

23. Expression des gènes • Étude de l’expression • Extraction des ARNs • Reverse Transcriptase • PCR semi quantitative et quantitative Blocage de l’expression  siRNA

24. Extraction d’ARN • Enlever le milieu de culture • Ajouter le Trizol • Gratter avec une spatule • Récupérer dans un tube Conservation à -80°C Dosage à 260 nm Ajout Chloroforme Resuspension dans l’eau UP Lavage à l’Ethanol 70°C Vortex Incubation sur glace Phase aqueuse = ARN totaux Centrifugation Ajout Isopropanol = Précipitation ARN à -20°C Centrifugation Protéines Phénol + Chloroforme = Débris cellulaires Culot d’ARN Extraction d’ARN Cellules en culture

25. Transcription inverse Transcription inverse (1) • ARN  ADN complémentaire • Molécule moins fragile • Conservation à -20°C • Sélection des ARNm • Matrice pour la réaction d’amplification Enzyme  Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN

26. Transcription inverse 10 min à 70°C DTT TTTTTTTTT Amorce oligo dT TTTTTTTTT ADNc Transcription inverse (2) Kits commerciaux avec: - Enzyme + tampon d’activité - dNTPs en quantité suffisante - DTT  élimination des structures 2aires des ARNs - Amorces polydT  sélection des ARNm AAAAAAAA AAAAA 1h – 37°C 15 min – 70°C ARNm

27. PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) • Méthode d’amplification génique in vitro • Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (pg) d'acide nucléique • Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse (20 à 25 nucléotides)  obtention d’un amplicon de taille connue Basée sur: • L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables • Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température

28. PCR PCR: étapes d’un cycle

29. PCR PCR: en pratique • Animation Flash • Au final, on obtient un très grand nombre de copies du gène d’intérêt, visualisables sur gel

30. PCR M échantillons PCR: dépôt sur gel • Gel d’agarose = maillage • Plus solide et moins toxique que l’acrylamide • ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire) • Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments • Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant) - Ajouté lors de la préparation du gel - En solution dans laquelle le gel est plongé après migration

31. PCR PCR quantitative ou en temps réel • A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent. • Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale d’ADN cible 2 techniques: - agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green) - sondes fluorescentes (ex: Taqman) 2 conditions: - Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin - Pas d’inhibition de la réaction de PCR

32. PCR PCRq: SYBR Green • Étape de dénaturation: le colorant libre émet peu de fluorescence • Étape d’hybridation et d’élongation:  fluorescence associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin • Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence est observée pendant l’étape de polymérisation et l’émission fluorescente décroît complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante  Étape de dénaturation: extinction de la fluorescence • Mesure à la fin de l’étape d’élongation

33. PCR PCRq: SYBR Green Avantages: • Utilisation simple • Pas de sonde • Nécessité d’amorces spécifiques • Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible Inconvénient • Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin  Visualisation des produits aspécifiques

34. PCR  Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine). PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde • Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR.  Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que d’émettre de la fluorescence.

35. PCR PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde • Hybridation de la sonde • Fixation de l’amorce et élongation • Hydrolyse de la sonde  Émission de fluorescence L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde

36. PCR PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde Précautions: • Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime la fluorescence de l’émetteur même après clivage • Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation Avantage:  Plus spécifique Inconvénient:  Pas idéale pour la détection des mutations

37. PCR PCRq: Cycle seuil (Ct) • Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence • Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité d’amplicons produits à un instant précis • Plus il y a de matrices à amplifier au départ de la réaction de PCR, moins élevé sera le nombre de cycles requis pour atteindre un point où le signal d’émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond) • Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification.

38. PCR PCRq: Courbe de fusion « Melting curve » • Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin. • Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification • 45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en continu

39. PCR PCRq: Courbe de fusion « Melting curve » • Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température • Vérification de la spécificité des sondes

40. PCR PCRq vs PCR classique • Quelques ng d’ADN suffisent • Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30) • Sensibilité • Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue) • Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps

42. Autre aplication de la qpcr

43. Etude interaction proteine proteine Co Immuno précipitation Fret colocalisation

44. Etude interaction proteine adn gemsa ship Trans activation

45. Régulation expérimental de l’expression des gène Transfection Si RNA

46. Les animaux transgenic Transgenique Ko Et conditionelle

47. ne correspondent pas toujours Conclusions • Importance des outils de la biologie moléculaire Etude de l’expression génique - Transcriptionnel (ARNm) - Traductionnel (Protéines) Etudes de localisation - Localisation fonctionnelle - Physiologique vs pathologique • Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante - Spécificité (anticorps, amorces, etc…)