Cours M1 - 2012

1. Cours M1 - 2012 Introduction aux techniques de biologie moléculaire Partie 2

4. Western-blot • Extraction des protéines: • Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases • - Tris-HCl • Séparation fraction/extraits totaux • - Centrifugation • - Ultracentrifugation Surnageant = Protéines Débris cellulaires Extraction des protéines Echantillon d’origine:  Tissu (foie, cœur, etc…)  Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)

5. Western-blot Dosage des protéines • - Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry: • Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+ • Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin • Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm • Peu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite • - Méthode de Bradford: • Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe) • Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm) • Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents • Méthode BCA • Acide bicinchonique • Formation complexe coloré avec Cu+ • Couleur violette, pic abs à 562 nm • Très sensible, rapide, compatible avec les détergents

6. Western-blot Echantillon à doser Distribution Mesure au spectrophotomètre DO Droite étalonnage DO échantillon Concentration Conc échantillon Dosage des protéines: exemple Solution d’Albumine bovine à 1 mg/mL Dilution en séries

7. Western-blot Gel de concentration (pH 6,8) 5% acrylamide) Dépôt et migration des échantillons Gel SDS-page Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis Gel de séparation (pH 8,8) 5-15% acrylamide Sens de migration + pourcentage est élevé + densité réseau est élevée + mailles sont serrées

8. Western-blot Séparation selon le poids moléculaire des protéines Dépôt et migration des échantillons • Solution de dépôt: • - Tampon HCl pH 6,8  Idem gel de concentration • Bleu de bromophénol  Suivi de la migration • Glycérol  Densifier l’échantillon

9. Western-blot Coloration du gel • Contrôle de l’homogénéité de la migration • Vérification de la présence de protéines • Bleu de Coomassie (coloration homogène) • Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)

10. Western-blot Transfert sur membrane • - Pression, application d’un courant • Fixation des protéines de façon non-spécifique: • - Interactions ioniques • - Interaction hydrophobes • - Membranes nitrocellulose / PVDF

11. Western-blot Coloration de la membrane • Contrôle de l’efficacité du transfert • Contrôle de l’homogénéité des dépôts • Coloration réversible

12. Immunocytochimie Ex: Fluorescéine Absorption des radiations bleues (max 490 nm) Émission d’une fluorescence verte (max 520 nm) Les fluorochromes • Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation • Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption - un spectre d’émission

13. Immunocytochimie Emission Fluorescence Laser Les fluorochromes Diagramme de Jablonski S1 État excité Niveau d’énergie des électrons d’une molécule fluorescente S0 État fondamental Absorption

14. Gel retard Étude des facteurs de transcription Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Facteur de transcription activé Recrutement du complexe d’activation de la transcription ADN Séquence de fixation spécifique TATA box Gène • Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible

15. Gel retard Principe (1) • Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.  Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.  Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la forme radioactive.  Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard plus important sur le gel appelé " supershift ".

16. Gel retard Sondes spécifiques marquées au P32 Protéines nucléaires extraites * * * * * * * * * + * * * * * * * * * - Fixation de la protéine sur sa séquence cible - Élimination des autres Sonde + protéine + Ac = « Super-Shift » Dépôt sur un gel natif Sonde + protéine Sonde libre Principe (2)

17. Gel retard Résultats Extraits nucléaires de cellules Hela Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires - Manipulation de la radioactivité

18. Immunocytochimie Le microscope à fluorescence • Filtre correspondant au fluorochrome utilisé • Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine: 490 nm) • Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par transmission que les radiations vertes (fluorescéine: > 500 nm) • Filtre d’émission (6): ne laisse passer par transmission que les radiations vertes (fluorescéine: > 500 nm) 1-lampe à arc 2-filtre d'excitation 3-miroir dichroïque 4-objectif 5-préparation 6-filtre d'émission 7-oculaire

19. Immunocytochimie Le filtre d'excitation sélectionne les radiations spécifiques du fluorochrome... ...qui sont réfléchies par le miroir et éclairent l'échantillon... ...celui-ci émet les radiations de fluorescence qui seules atteignent l'oculaire. Le microscope à fluorescence Ex: Fluorescéine

20. siRNA small interfering RNA (siRNA) • ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine • Mécanisme très spécifique • Permet l’étude des gènes

21. siRNA Ribonucléase qui clive l’ARN double brin toutes les 21 à 25 pb Complexe RISC (RNA-Induced Silencer Complex) DICER DICER Clivage de l’ARNm cible par RISC Elimination d’un des brins du siSNA, dit « passager » RNA interférence ARN double brin introduit dans la cellule (siRNA) Ciblage des ARNm de la cellule possédant une séquence complémentaire

22. siRNA Anand et al., 2007 Frede et al., 2005 RNA interférence • Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible •  Mécanisme très spécifique • Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage • Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip • Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine

23. Extraction d’ARN Extraction d’ARN • Molécules très fragiles • - Matériels stérile, RNAses et DNAses free • - Travail sur glace • - Port de gants • - Pointes avec filtre • Extraction Phénol/Chloroforme • Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN • - Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines • - Anti-RNases