Efecto antiapoptótico de la Eritropoyetina en células de neuroblastoma

1. Efecto antiapoptótico de la Eritropoyetina en células de neuroblastoma Nicolás Pregi

2. Eritropoyetina (Epo) • Es una hormona proteica altamente glicosilada de 30.400 Da • Regula principalmente la producción de glóbulos rojos • Es producida, en grandes cantidades, por las células peritubulares del riñón en adultos y por los hepatocitos en el feto y en menor cantidad por el hígado en adultos • Su forma de acción es mediante la unión a su receptor específico (EpoR), desencadenando una cascada de señales intracelulares • El gen de la Epo presenta una zona de 50 pb en su extremo 3’ denominado hypoxia enhancer site, donde se une el factor de transcripción HiF 1, responsable de la expresión del gen en condiciones de hipoxia • Para tratamiento de pacientes se utiliza eritropoyetina recombinante humana (rHuEpo), también denominada epoietina, la cual difiere en su estructura

3. Historia • Ha pasado casi un siglo desde que Carnot y Deflandre postularon que un factor humoral, al que denominaron HEMOPOIETINA, regularía la producción de glóbulos rojos (1905) • En 1936 Hjort demostró y confirmó la existencia de dicho factor • En 1950 Reissmann demostró que el gen de dicho factor era regulado por la presión de oxígeno • Miyake reportó la purificación de eritropoyetina humana en 1977 • Lin y Jacobs clonaron el gen de Epo y desarrollaron una línea celular transfectada (células CHO) que producía eritropoyetina recombinante humana para uso clínico en 1985 • Una nueva molécula ha sido recientemente sintetizada (2000), denominada NESP (New Erythropoiesis stimulating protein) o también Darbepoetina, presenta mayor grado de glicosilación, otorgándole mayor vida media en plasma

4. Sitios de producción de Epo • Koury y Lacombe, utilizando la técnica de hibridización in situ demostraron que las células peritubulares (intersticiales o endoteliales) producían Epo • Maxwell y Loya, utilizando ratones transgénicos, reportaron que las células epiteliales tubulares eran las encargadas de la producción de Epo • Otros estudios difieren con estos datos y aún quedan controversias acerca del lugar exacto de producción de Epo en el riñón humano • También es producida por el hígado en cantidades mucho menor • Se ha demostrado que células de tejido nervioso central producirían Epo, aunque aún no se conoce exactamente el lugar donde ocurriría dicha producción

5. Con permiso de Terry Lappin

6. Receptor de Eritropoyetina (EpoR) • El número de receptores varía entre las distintas células del linaje eritroide desde las BFU-E hasta los normoblastos, siendo mayor en las CFU-E, y en grado decreciente a medida que las células eritroides se diferencian y maduran (los eritrocitos maduros no contienen receptores) • El EpoR fue clonado de una línea celular eritroleucémica murina en 1989 • Es una proteína que varía entre los 66 y los 78 kDa, y normalmente se encuentra como dímero preformado • Cuando se une la Epo al receptor, éste cambia de conformación • Presenta dos sitios de unión a Epo, uno de alta afinidad (kD ~ 1 nM) y otro de baja afinidad (kD ~ 2 uM) • El propio receptor no posee actividad kinasa de ningún tipo • Se expresa además en cerebro, retina, ovario, útero y testículos

7. EpoR Dominio extracelular Sitio de unión de JaK 2 Tirosinas fosforiladas luego de la activación del EpoR

8. Señalización intracelular • Cuando la Epo se une a su receptor, éste se dimeriza • La proteína Jak 2 se encuentra asociada al receptor constitutivamente • Cuando éste se dimeriza, Jak 2 se transfosforila, y fosforila ciertos residuos tirosina del receptor (8 en total), como así también otras proteínas involucradas en la cascada de señales • Los residuos tirosina fosforilados en el receptor sirven como sitios de unión para proteínas que contengan el dominio SH2 • La Pi3 K se une a la tirosina 479, mientras que el factor Stat 5 lo hace en la tirosina 343 • La activación del factor de transcripción Stat 5 esta relacionado con la proliferación, mientras que el factor ERK estaría relacionado con la diferenciación y la vía de PKB/Akt estaría relacionada con la supervivencia celular

9. Epo JaK 2 P P P P P P P P P P P P P P Stat 5 MEK Ras PKB/Akt Erk Grb 2 PI3 K CREB Stat 5 Stat 5 Erk Stat 5 Stat 5 Epo R Epo R Jak 2 Modelo celular

10. Uso terapéutico de la Epo • En 1987, Eschbach reportó los resultados combinados de la fase I y II de pruebas con Epo recombinante Humana (rHuEpo) en pacientes, en los cuales la anemia fue corregida • La rHuEpo fue aprobada para su uso con pacientes con falla renal crónica por la FDA en junio de 1989 • En el 2000 Eschbach delineó algunos principios para el uso de rHuEpo contra la anemia en pacientes con falla renal crónica • Debido a la falta de hierro en algunos pacientes con dicha enfermedad, el tratamiento con rHuEpo no siempre logra los resultados esperados, y aún no está claro cuanto y en que dosis y a que tiempo debe administrase el hierro a dichos pacientes • En algunos pacientes tratados con rHuEpo, si se detenía el tratamiento anticipadamente y en forma brusca, los niveles de hemoglobina descendían aún más

11. Otros efectos del tratamiento con Epo • En algunos casos se he reportado el aumento de la presión en pacientes tratados con rHuEpo, hecho que podría deberse a la regulación de la producción de NO y aumento de calcio intracelular • Se ha demostrado el efecto angiogénico de la Epo en distintos sistemas celulares • También se ha demostrado la regulación que produciría la Epo sobre distintas prostaglandinas • En experimentos con ratones que sobrexpresan Epo, se observó eritrocitosis, que llevó a disfunción cardíaca y muerte prematura • Se ha detectado una supresión de los progenitores eritroides en pacientes con SIDA, tratados con Zidovudina • Pacientes que sufrieron un shock y fueron tratados con Epo, mostraron un menor volumen del infarto y una recuperación más rápida a nivel neurológico

12. NESP (Darbepoetina) • Fue desarrollada para el tratamiento de la anemia • Es un análogo hiperglicosilado de la rHuEpo, lo que le confiere una vida media en plasma tres veces mayor • NESP contiene cinco cadenas laterales de hidratos de carbono, mientras que la Epo nativa contiene sólo tres • NESP difiere en cinco aminoácidos respecto de la Epo nativa, lo cual le permite la incorporación de las dos cadenas extra de hidratos de carbono • NESP produciría menor cantidad de anticuerpos reactivos, confiriéndole menor cantidad de efectos secundarios • NESP induce la misma cascada de señales que la Epo nativa (JaK2/Stat 5, PI3K, y Ras/MAPK) • El clearance de NESP es mucho menor que la Epo nativa, pudiéndose espaciar más las dosis del tratamiento • Recientes estudios con pacientes con falla renal crónica tratados con NESP demostraron la mayor eficacia de ésta y la menor cantidad de efectos secundarios

13. Epo y el sistema nervioso central • Ya han pasado cinco años desde que se demostró que la Epo presenta actividad neurotrófica, situándola como una molécula multifuncional a nivel autócrino y parácrino • Entre los efectos denominados no-eritropoyéticos de la Epo incluimos su rol crítico en desarrollo, mantenimiento, protección y reparación del sistema nervioso • La Epo producida por el cerebro es de tamaño menor que la circulante en plasma debido a un menor grado de glicosilación • Es producida por los astrocitos, mientras que las neuronas son las células target • Por experimentos con ratones transgénicos se ha demostrado que la Epo cumple un rol crucial en el desarrollo del cerebro • Epo protege a las neuronas de hipoxia química, isquemia y otras injurias en el cerebro • Por medio de un cross-talk entre distintas proteínas, se activaría el factor de transcripción NfκB, el cual regularía la expresión de ciertas proteínas involucradas con procesos inflamatorios

14. Células de Neuroblastoma • Las células de neuroblastoma en general provienen de tumores avanzados del sistema simpático-adrenérgico-ganglial • Las células SH-SY5Y son un subclon de la línea celular SK-N-SH, y fue establecida de un tumor maligno • Las células SH-SY5Y no responden al NGF debido a la baja expresión de TrkA • La línea celular SH-SY5Y puede ser inducida a diferenciarse mediante el tratamiento de distintos agentes químicos • Hemos demostrado la expresión del EpoR en esta línea celular mediante RT-PCR • Responden a Epo de forma dosis dependiente y regularían la expresión de ciertos genes cuyos productos están relacionados con la apoptosis

15. 2,5 2 1,5 Grado de Apoptosis 1 0,5 0 a b c Resultados experimentales Inducción de Apoptosis distintas dosis de Staurosporina

16. 1 2 40 35 30 4 3 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 Resultados experimentales Microscopía de fluorescencia

17. 1 2 3 4 2,5 2 1,5 interconexión de neuritas Grado de elongación e 1 0,5 0 1 2 3 4 Resultados experimentales Diferenciación celular inducida por la Staurosporina Determinación del grado de elongación e interconexión de neuritas

18. 300000 250000 200000 150000 Unidades arbitrarias 100000 50000 0 a b c d e f g h Resultados experimentales Inhibición de la apoptosis por Epo y reversión de dicho efecto utilizando wortmanina

19. Resultados experimentales Regulación de la expresión del EpoR Expresión en el tiempo del mRNA de EpoR, luego del tratamiento con Epo

20. Resultados experimentales Regulación de la expresión de factores antiapoptóticos de la familia bcl-2 Expresión en el tiempo (luego del tratamiento con Epo) del mRNA de bcl-2 y bcl-Xl

21. Conclusiones La línea celular SH-SY5Y presenta características y propiedades excelentes para el propósito de éste estudio La staurosporina es un agente eficaz como inductor de apoptosis en dicha línea celular La Staurosporina produce diferenciación celular acompañada de un proceso apoptótico en forma dosis respuesta La Epo previene la muerte celular programada en dicha línea celular El efecto antiapoptótico de la Epo sería mediado por el aumento de la expresión de ciertos factores antiapoptóticos como bcl-2 y bcl-Xl La regulación de dichos factores antiapoptóticos estaría mediada por la vía de la PI3K

22. Discusión La apoptosis es un programa de suicidio celular fisiológico que resulta crítico para el desarrollo y el mantenimiento de tejidos y órganos. Debido a que el papel fisiológico de la apoptosis es crucial, la alteración de este proceso puede desencadenar patología La apoptosis no programada fisiológicamente de ciertas neuronas del cerebro contribuye al desarrollo de patologías como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, mientras que un defecto en la iniciación de la apoptosis de ciertas células con serios daños en su ADN, provoca cáncer El profundo estudio y la posterior comprensión de los mecanismos involucrados en el efecto antiapoptótico, como así también sus posibles efectos antioxidantes como antinflamatorios, de la Eritropoyetina, podrían ser utilizados en futuras formas de terapia Estudios con diseños de distintos análogos de la Epo con distintos grados de glicosilación podrían mejorar su eficacia como agente terapéutico

23. Muchas gracias a todos por escuchar esta charla Nicolás Pregi