EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CÉLULAS

1. EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CÉLULAS PARTE II

2. CONSIDERAÇÕES GERAIS Agentes ou produtos ambientais (radiação ionizante) REPARO Letalidade celular Envelhecimento precoce Malformação Câncer DANO NÃO REPARADO DANO DNA TÉCNICAS (EM NÍVEL CELULAR) Aberrações cromossômicas Citogenéticas Micronúcleos Troca entre cromátides irmãs Bioquímicas Cometa Moleculares Hibridização in situ Dosimetria biológica Genética toxicológica Biomonitoramento Instabilidade genômica IDENTIFICAÇÃO DE MANIFESTAÇÕES CELULARES OU MUTAÇÕES

3. INDICADORES BIOLÓGICOS MÉTODO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS • aberrações cromossômicas Métodos - micronúcleos • Cometa (“single cell gel assay”) Formação: quebras nos cromossomos quebras na fita dupla do DNA reparo não reparo reparo errôneo (deleção) (rearranjo) cromossomo aberrações cromossômicas normal estruturais Aberração cromossômica qualquer fase do ciclo celular metáfase G1- tipo cromossômico S - cromossômico + cromatídico G2 - tipo cromatídico necessitam de quebras nos cromossomos

4. ABERRAÇÃO TIPO CROMOSSÔMICO

5. ABERRAÇÃO TIPO CROMATÍDICO

6. ABERRAÇÕES CROMOSÔMICAS RADIOINDUZIDAS QUEBRA EM G1 REJUNÇÃO METÁFASE REPLICAÇÃO FRAGMENTO ACÊNTRICO ANEL COM FRAGMENTO ACÊNTRICO DICÊNTRICO COM FRAGMENTO ACÊNTRICO TRICÊNTRICO COM FRAGMENTO ACÊNTRICO

7. DOSIMETRIA BIOLÓGICA ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA frequência de aberrações encontadas em linfócitos de indivíduos expostos frequência observada em lifócitos irradiados in vitro com doses conhecidas Curvas dose - resposta LINFÓCITOS “dosímetros biológicos” - altamente radiossensíveis - população naturalmente sincrônica de células - ampla distribuição corpórea (G0 G1) - facilmente coletadas - in vitro = in vivo

8. Moorhead et al. (1960) - desenvolvimento de técnicas de cultivo de linfócitos humanos in vitro, utilizando um mitogênico. Linfócitos células blásticas MITOSE (G0 G1) PHA (Phaseolus vulgaris) Bender e Gooch (1962) - propuseram a análise de aberrações cromossômicas para a avaliação quantitativa de dose absorvida de radiação.

9. CULTURA DE LINFÓCITOS (48 h)(Construção de Curva de Calibração) - Coleta do sangue (5 mL) - Fracionamento de amostras sanguíneas e irradiação com várias doses (10-500 cGy) - Cultivo a 37oC sangue total + meio de + soro fetal + mitogênico + antibiótico (0,5 mL) cultura bovino PHA - Adição de colchicina (2h antes da fixação) - Adição de solução hipotônica (KCl 0,075 M) - Fixação com metanol + ácido acético (3:1) - Preparação de l6aminas: fixação a 65oC - Coloração com Giemsa a 2% 1adivisão em cultura: 40 54 h -BrdU 2adivisão: 72 h -critérios 48h padronização da técnica Cada laboratório obtenção de curva - padrão - Sensibilidade da técnica: estimativa de dose, da ordem de 5 cGy de radiação de baixa LET - para cada dose de radiação: pelo menos 100 metáfases analisadas

10. CROMOSSOMOS ARLEQUIM Trocas entre cromátides – irmãs em cromossomos mitóticos. Corados com Hoechst – 33238 e acridine orange, observados ao microscópio de fluorescência

13. CURVA DOSE-RESPOSTA Todos os tipos de radiação ionizante – mesmo tipo de aberrações cromossômicas em células expostas Frequência de aberrações induzidas – depende da dose, depende do tipo de radiação LET = quantidade de E depositada na matéria por unidade de comprimento do trajeto (keV/mm) alto LET x x x x x x x x baixo LET x x x x x x x x Ilustração diagramática da densidade de ionização relativa por alvo de uma trajetória simples para radiação de alta e baixa LET

14. Energia média do neutron (MeV) 0,7 7,6 14,7 Raios X 250 kVp a 1,0 Gy/min 2,0 1,5 Radiação g de 60Co a 0,5 Gy/min Dicêntricos por célula 1,0 0,5 1 2 3 4 5 Dose (Gy) baixa LET y = a0 + bD2 (R-X, R-g) y = a0 + aD+ bD2 a0 FA = 1 em 300 células a0 D = 1 em 2000 células alta LET y = a0 + aD (n, p, a)

15. Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneoshumano, expostos in vitro ao 37Cs com taxa de dose de 5 cGy.min.-1 Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneos humano, expostos in vitro ao 60 Co com taxa de dose de 5 cGy.min.-1

16. CURVA DOSE – RESPOSTARADIAÇÃO DE BAIXA LET Aberração cromossômica resultante de 2 quebras (anéis, dicêntricos) y = a0 + aD+ bD2 a = ba / b termo linear dicêntrico única trajetória ionizante (1 ou 2 quebras) independe da taxa de dose doses mais baixas da curva aD termo quadrático dicêntrico interação de 2 trajetórias ionizantes independente depende da taxa de dose: zona de rejunção < 0,1 mm doses mais altas da curva bD2

18. MÉTODO DO MICRONÚCLEO Origem - fragmentos acêntricos - cromossomos inteiros Tamanho- 1 a 1 de do núcleo principal Indicadores - agentes clastogênicos - agentes aneugêncios Schmidt (1975) – células da medula óssea de camundongos Countryman e Heddle (1976) – relação quantitativa entre a dose e a frequência de MN em linfócitos humanos 20 5

19. Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células mononucleadas METÁFASE EFEITO GENOTÓXICO ANÁFASE CÉLULA ANORMAL CÉLULA NORMAL CÉLULA FILHA NORMAL CÉLULA MICRONUCLEADA CÉLULAS -FILHAS NORMAIS

20. Fenech & Morley (1985) – “cytokinesis block method” Citocalasina B – Helminthosporum dematoideum inibe a citocinese, mas não a carciocinese célula binucleada (1 divisão nuclear) Cultivo: adição de cito B, 44 horas após tratamento isotônico – preservação do citoplasma para cada dose – 500 células binucleadas Desvantagem - não oferece toda a informação - 10 a 12 MN / 1000 binucleadas Vantagens - relativamente simples e sensível - análise mais rápida - bom indicador de dano genético - magnitude do dano ocorrido

21. Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células binucleadas METÁFASE EFEITO GENOTÓXICO ADIÇÃO DE CITOCALASINA B ANÁFASE CÉLULA NORMAL CÉLULA ANORMAL CÉLULA MICRONUCLEADA CÉLULA NORMAL

22. Parâmetros: • frequência de células com MN • (incidência de células afetadas) • -distribuição de MN • (extensão do dano ocorrido) • 0, 1, 2, 3, 4, 5 MN por célula • >5 MN - desprezado

25. TESTE DO COMETA(“SINGLE CELL GEL ASSAY”) Ostling & Johanson (1984) – técnica eletroforética de microgel condição neutra quebra na dupla fita direta visualização do dano em nível de célula individual Singh et al. (1988) – condição alcalina quebra na fita sítios simples álcali-lábeis

26. Número e tipo de lesões radio – induzidas no DNA (Resnick (67), Warters e Childers (74) e Wlodek e Hittelman (75)) Tipo de lesão Número por gray Quebra fita dupla (dsb) 40 Quebra simples fita (ssb) 500 – 1000 Dano na base 1000 – 2000 Dano no acúcar 800 – 1600 ligações cruzadas (crosslinks) DNA – DNA 30 ligações cruzadas DNA – proteínas 150 Sítos álcali – lábeis 200 - 300 1 Gy de radiação 1 quebra na 25 quebras na fita de baixa LET fita dupla na fita simples / cromossomo

27. PRINCÍPIO DO MÉTODO • DNA nuclear altamente organizado • Molécula de DNA de células de eucarioto • (50 – 100 cm de comprimento) 105 x núcleo (5-10 mm ) Interpretação esquemática do padrão de migração do DNA, formando estrutura semelhante ao do cometa

29. TÉCNICA DE ELETROFORESE DE MICROGEL

30. PARÂMETROS • Comprimento da imagem ou do Cometa ( cabeça + cauda) DNA do nucleóide DNA que migrou • Comprimento da Cauda (distância de migração de DNA) magnitude de dano ocorrido • Área do Cometa • “Tail moment” = quantidade DNA X comprimento na cauda da cauda intensidade de fluorescência

31. VANTAGENS • Análise direta do dano no DNA em nível de célula individual • Quantidade pequena de células ( da ordem de mL) • Relativa facilidade na obtenção de dados • Análise de 50 células / dose • Sensibilidade: 5 cGy de radiação de baixa LET • Estudo de danos no DNA e reparo: danos oxidativos, dosimetria biológica, biomonitoramento e estudos de apoptose

32. Radiação g de 60Co

33. Radiação g de 60Co

34. Radiação b de 90Sr