Podsumowanie – wykład 5

1. Transformacje komórek roślinnych – rośliny GMO • Metody transformacji • wektorowe • bezwektorowe • Typy wektorów: • -plazmidowe • -fagowe • -hybrydowe (kosmidy) • -sztuczne chromosomy (BAC, YAC) • -wektory binarne • Transformacja wektorowa z użyciem Agrobacteriumtumefaciens i rhizogenes • plazmid Ti (T-DNA) • zanurzanie kwiatów w zawiesinie bakteryjnej (floral dip) • Transformacje bezwektorowe • Mikrowstrzeliwanie • Włókna krzemowo-karbidowe • PTP-pollen tubepathway Podsumowanie – wykład 5

2. Transformacja genetyczna Transformacja genetyczna polega na wprowadzeniu fragmentu DNA dawcy (jednego lub kilku genów) do genomu biorcy nadając mu nowe, unikalne cechy. • GMO – geneticallymodifiedorganism • GM • Rośliny poddane transformacjom (rośliny transgeniczne) z konstruktami genowymi są: • odporne na herbicycy • odporne na choroby • odporne na owady roślinożerne • odporne na niekorzystne warunki środowiska • z poprawionymi cechami użytkowymi np. lepsze plonowanie, większa zawartość składników odżywczych, witamin

3. Metody transformacji roślin

4. Wektory Plazmid – pozachromosomowa, kolista cząsteczka DNA zawierająca niezależny początek replikacji; wektoryplazmidowe są plazmidami sztucznie zmodyfikowanymi; pozwalają na klonowanie fragmentów DNA do 10 kpz; Wektory plazmidowe • Typowe modyfikacje: • Stałe miejsce do klonowania zawierające szereg unikalnych miejsc restrykcyjnych (polilinker) • Obecność co najmniej jednego markera selekcyjnego (np. oporności na antybiotyki AmpR) • Miejsce ori –(repilikacja) determinuje obecność setek kopii plazmidu na pojedynczą komórkę • Sekwencje promotorów polimerazy RNA

5. Transformacja wektorowa Mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T-transfer(T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Usuwając geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, można na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego organizmu. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacteriumtumefaciens Agrobacterium tumefaciens Agrobacteriumtumefaciensnaturalnie infekuje (najczęściej w miejscu zranienia) ponad 160 gatunków roślin powodując guzowatość * * żeby bakteria była onkogenna musi zawierać plazmid Ti (ang. Tumor inducing).

6. Plazmid Ti z Agrobacteriumtumefaciens Analiza genetyczna wykazała, że dwa regiony plazmidu Ti są niezbędne do powstania guza: T-DNA i region vir (virulence). T-DNA zawiera geny związane z produkcją fitohormonów (auksyn, cytokinin) Nadprodukcja tych hormonów podwyższa tempo podziału komórki, zapobiega różnicowaniu i w rezultacie powoduje powstanie guza Inne geny T-DNA odpowiedzialne są za syntezę aminokwasówi pochodnych argininy zwanych opinami, (źródło C i N) oraz za ich wydzielanie z komórki roślinnej; Rodzaj syntetyzowanych opin jest podstawą klasyfikacji plazmidów: np..nopalinowe, oktopinowe, atropinowe. Fragment T-DNA jest ograniczony krótkimi (24-25 n) sekwencjami granicznymi LB i RB (miejsca nacięcia T-DNA) 200kpz

7. Geny wirulencji (vir) • Fragment vir(angvirulence) znajdujący się poza T-DNA o wielkości od 30-40 kpz zawiera geny zaangażowane w proces transformacji położone w obrębie 6 operonów: • virA (1) • virB (11) • virC (2) • virD (4) • virE(2) • virG (1) • virF (1) • virH (2) A B C D E G Nie są związane z przenoszeniem T-DNA; ale istotne dla transformacji niektórych gatunków np. virF- kukurydza Operony virA i virG ulegają stałej ekspresji na niskim poziomie; produkt białkowy virA jest białkiem transmembranowym reagującym na związki fenolowe i monocukry wydzielane przez zranioną tkankę roślinną. Aktywuje również białko virG, które działa jako czynnik transkrypcyjny dla pozostałych vir. Vir D- koduje endonuleazy, które wycinają T-DNA w obszarze LB. Vir C stymuluje proces przenoszenia T-DNA. Vir B- tworzą kanał transferowy przez który wnika T-DNA

8. Transformacje bezwektorowe Metody bezwektorowe nie wymagają użycia wektorów w postaci Agrobateriumtumefaciensczy A. rhizogenes Stosowane są do transformacji w tych przypadkach kiedy rośliny są niewrażliwe na agroinfekcje. Wadą transformacji bezwektorowej jest brak ochronny DNA dawcy przed uszkodzeniami i wprowadzenie wielu kopii transgenu do genomu biorcy. Niezbędnym etapem jest poddanie komórek roślinnych działaniu enzymu usuwającego ścianę komórkową. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.

9. Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych • Fuzja liposomów-tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie -powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA • Z użyciem PEG, chemiczna -polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethyleneglycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym • Mikroiniekcja-polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco-i czasochłonna

10. PTP- polentubepathawy • Wykorzystuje naturalny proces wzrostu łagiewki pyłowej przez słupek do woreczka zalążkowego, w którym dochodzi do podwójnego zapłodnienia: jedno z jąder plemnikowych migrujących wraz z łagiewką zlewa się z komórką jajową, co prowadzi do powstania zygoty, a drugie ulega fuzji z jądrem komórki centralnej dając początek endospermie. • Tą samą drogę może przebyć obcy DNA do zalążka, który będzie umieszczony na powierzchni słupka. W tym celu skraca się szyjkę słupka i usuwa znamię, a plazmidowy DNA umieszcza się bezpośrednio na odciętej powierzchni. • W wyniku transformacji metodą PTP przeniesiono do bawełny odporność na chorobę grzybową; wprowadzono gen gna i cryl do pszenicy, które warunkują odporność na owady; u cyklamenu wprowadzono gen CHS z petunii – nowe barwy kwiatów.