Grundlagen der Durchflusszytometrie

1. Grundlagen der Durchflusszytometrie

2. Gliederung • Was ist ein Durchflusszytometer? • Teile eines Durchflusszytometers • Flüssigkeitssystem • Optik • Elektronik • Computer • Instrumentsettings • Beispielsmessung

3. Diese Partikel haben etwas gemeinsam . Blood cells Chromosomes Protozoa Algae Einige ihrer Eigenschaften können mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden.

4. Was ist ein Durchflusszytometer? Grundlegend ist ein Durchflusszytometer ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop. (Erste Prototypen sahen auch so aus)

5. Detector & Counter Diese einfache Darstellung zeigt das Grundprinzip eines Durchflusszytometers: Zellen werden in einer Durchflussküvette an einer Mikroskopoptik vorbei geführt. Waste Sample Das automatisierte Mikroskop

6. Das Durchflusszytometer

7. Welche Parameter können gemessen werden? • die relative Zellgrösse (Forward Scatter - FSC) • die Granularität oder innere Komplexität (Side Scatter - SSC) • die Fluoreszenzintensität (FL1, FL2, up to FL X)

8. Teile eines Durchflusszytometers • Flüssigkeitssystem • Liefert einen konstanten Hüllflüssigkeitsstrom • Transportiert die Probe in die Küvette • Fokussiert die Zellen im LASER-Strahl • Optik • Fokussiert das Anregungslicht • Sammelt das emittierte Licht • Elektronik • Wandelt Lichtsignale in elektrische Signale um • Sendet die Signale zum Auswerterechner • Computer • Stellt Daten graphisch dar • Kontrolliert die „Instrument Settings“

9. Forward scatter Cell size (488 nm) Coherent lightsource (488 nm) Side scatter Granularity (488 nm) Charakteristiken von FSC und SSC • Side scatter (SSC) • gemessen im 90° Winkel zum einfallenden Licht • proportional zur Zellkomplexität und Granularität • Forward scatter (FSC) • gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes • proportional zur Zellgrösse / Zelloberfläche (nur bei runden Zellen)

10. Beispiel: Blut Granulozyten Side scatter Monozyten Lymphozyten Debris Forward scatter

11. Fluoreszenz l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light • Die Fluorochrome absorbieren die Energie des Anregungslichtes. • Die absorbierte Energie wird abgegeben als: • Schwingungsenergie und Wärme • Emission eines Photons mit grösserer Wellenlänge ( = geringere Energie)

12. FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Fluoreszenzintensität Number of Events 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity

13. Hydrodynamische Fokussierung Sample Sheath

14. Optische Filter LongpassShortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 LP 500 SP 500 BP500/80

15. Octagon Detection System PerCP-Cy5.5 FITC 695/40 655 LP SSC PE PE-Cy7

16. Elektronik • Wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um • Digitalisiert die Signale • Analysiert die -Höhe [Height (H)], -Weite [Width (W)] und die -Fläche [Area (A)] des Spannungspulses • Übermittelt die Daten an den Auswerterechner

17. t 1. 2. 3. Laser Voltage t Laser Voltage t Laser Entstehung eines Spannungspulses Voltage

18. Auswertung eines Spannungspulses Pulse Area (A) Pulse Height (H) Voltage 0 40 Time (µs) Pulse Width (W)

19. Schwellenwert (Threshold) Der Schwellenwert gibt die minimale Signalintensität an, die an dem jeweiligen Kanal erreicht werden muss. Alle Signale mit geringerer Intensität werden nicht dargestellt.

20. Zusammenfassung • Während die Zellen den LASER-Strahl passieren, werden Spannungspulse am Photomultiplier generiert • Das Signal wird verstärkt • Die Elektronik digitalisiert das Signal mit einer Frequenz von 10MHz • Nur Signale, die den gewünschten Schwellenwert überschreiten, werden analysiert und aufgezeichnet • Die Daten werden letztlich zum Analyserechner übermittelt, der mit dem Zytometer verbunden ist

21. Instrumentsettings • Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab • Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der Regel durch die Anwendung bedingt

22. Datenspeicherung Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv waren. Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet. Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen wurde.

23. Darstellung der Daten 1 1) Histogramm - ein Parameter, der die Fluoreszensintensität als Häufigkeitsverteilung dargestellt

24. 30 60 638 840 100 160 245 85 300 650 160 720 1000 800 600 400 200 0 Darstellung der Daten 2 2) Dotplot (Punktwolkendarstellung) - zwei Parameter werden auf der x- und y-Achse dargestellt Listmode file FSC SSC FL1 FL2 Event 1 Event 2 Event 3 840 FL2-H 85 0 400 600 800 1000 200 FL1-H 245 638

25. Enough theory of flow! Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:

26. Aufgabe: Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4+, CD3+ und CD8+ Zellen im Vollblut • Material • Milzzellen aus der Maus • Methode • Drei-Farben-Immunfluoreszenz Preparation • Färben von frisch isolierten Milzzellen Färbung • Ungefärbte Kontrolle • Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die • passenden Instrumentsettings zu bestimmen

27. Einstellung der FSC- und SSC-Spannung • FSC und SSC sind optimal eingestellt, wenn die zu untersuchende Population (z.B. Lymphozyten) von allen anderen Populationen zu unterscheiden ist • Der Schwellenwert des FSC wird so eingestellt, dass Debris überwiegend von der Datenauswertung ausgeschlossen wird

28. Parameter (I) • FSCund SSCn Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)n Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll, Fixierungsmethode) • nWerden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende Population für weitere Untersuchungen zu definieren

29. Parameter (II) • Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)n Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper, Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.) • nMeistens dient die Fluoreszenz als Marker für die statistische Analyse

30. „Gating“:Bestimmen der gewünschten Population

31. „Gating“ • Selektive Analyse definierter Zellpopulationen • Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt werden • Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen • Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen

32. Einstellung der Fluoreszenzsettings • A) Einstellen der PMT-Spannung • Probe: ungefärbte Kontrolle • Die gemessene Fluoreszenz wird als unspezifische Autofluoreszenz betrachtet. • Die Lymphozytenpopulation wurde vorher im FSC und SSC „gegated“. B) “Quadrantengating” Traditionell werden Quadranten benutzt um die 4 möglichen Populationen in einem 2-Farben-Experiment zu definieren. Bei Vielfarbenexperimenten ist diese Art des „Gatings“ nicht die optimale Lösung.

33. Q2 Q1 FITC + PE PE Q3 Q4 FITC negative „Quadrantengating“ FL2-H FL1-H

34. FL1 FL2 530/30 585/42 Relative Intensität 500nm 550nm 600nm 650nm 700nm Wellenlänge ( n m ) Fluoreszenzüberstrahlung

35. FL1 FL2 585/42 530/30 FITC-Kompensation Detektor - … % Signal Relative Intensität 550nm 600nm 650nm 700nm 500nm Wellenlänge (nm)

36. FL1 FL2 530/30 5 8 5 / 4 2 FITC-Kompensation Lowering the FITC-population is achieved by... ... Subtracting a percentage of FITC-intensity from the affected PE-channel ... … because 25% of the FITC-signal are actually detected in the PE channel ... Relative Intensity 500nm 550nm 600nm 650nm 700nm Wavelength (nm)

37. Zusammenfassung • FSC und SSC werden so eingestellt, dass die Population gut von anderen Populationen zu unterscheiden ist • Die gewünschte Population wird „gegatet“ • Die PMT Spannungen der Fluoreszenzkanäle werden mit der ungefärbten Kontrolle eingestellt • Einzelfärbungen werden eingemessen um Fluoreszezüberstrahlungen zu kompensieren