As escolhas dos linfócitos quando dão o Notch

1. As escolhas dos linfócitos quando dão o Notch Biologia do desenvolvimento Biologia Humana 2013/14 Docente: Paulo de Oliveira Discentes: Helena Pereira e Tatiana Yashechkina

2. Recetor NOtch • É uma proteína transmembranar de passagem única, que consiste em apenas um peptídeo. • É composto por: →uma componente extracelular que é responsável pela interação com os ligandos → um domínio transmembranar responsável pela ativação do recetor → um domínio de sinalização intracelular Os ligandos de NOTCH interagem com o recetor de células adjacentes por um processo designado inibição lateral. Essa ligação entre recetor e o ligando, leva a ativação da via NOTCH na célula e a supressão da atividade nas células adjacentes

3. Estrutura dos recetores NOtch • É composto por duas subunidades: • Um fragmento N-terminal extracelular (NEC) • Uma subunidade C-terminal transmembranar (NTM) • As subunidades NEC e NTM permanecem associadas no recetor em repouso através do domínio de heterodimerização (HD).

4. Estrutura do recetor NOtch • A subunidade EC é composta pelas porções EGF-Like, LNR e parte do HD. • A subunidade TM esta caracterizada por parte de HD, e porções RAM, ANK, TAD e PEST. ICN – intracellular domain of NOTCH1

5. Mecanismos de ativação do recetor NOTCH1 • O recetor NOTCH1 é ativado, pela interação de ligandos como Delta-Like e Jagged. • Ocorre uma mudança conformacional em LNR e dissociação das duas subunidades do domínio HD. • Seguindo a clivagem do recetor, primeiro pela metaloprotease ADAM10 (clivagem S2) e subsequentemente pelo complexo de gama-secretase (clivagem S3) • Esses processos proteolíticos libertam o domínio intracelular (ICN1) de NOTCH1 da membrana. • O ICN1 interage com o DNA através da sua ligação com CSL e recruta o coactivador MAML1 para ativar a expressão de genes alvos.

6. Hematopoietic stem cell (HSC) HSC Dão origem a todas as células sanguíneas

7. Auto-renovação das stem cells Proteínas de diferenciação Gene ld E-proteínas Prolonga a expessão do GATA-2 Linhagem mieloide Notch Linfócitos B E2A Hes1 EBF e PAX5

8. Escolhem ser T Notch Notch

9. HSC no timo Linfócitos T 0,018% T e NK TLMP CD34highCD33⁺ DN – percursor mais imaturo dos linfócitos T

10. thymic lymphomyeloid precursors (Tlmp) Notch GATA-2 Linfócitos T Linhagem Mieloide TLMP CD34highCD33⁺ Os percursores timicos ainda apresentam um vasto potencial de diferenciação em NK, DC, e até macrofagos. HEB, GABPα e GATA3, o gene pTα Notch IL-7, SCF, IL-1α, IL-6, GM-CSF GATA-2

11. Portanto a expressão de Notch1 é necessária e suficiente para impedir que as TLMPs se diferenciem em células não-T mas não é suficiente para induzir o rearranjo do gene TCR que garante a progressão da diferenciação dos linfócitos T em diferentes tipos de células T. • A sinalização intatimica de Notch é iniciada quando o receptor Notch1 recruta o seu ligando Dll4, que leva a activação da transcrição dos genes alvo do Notch.

12. IL-7R • Os resultados das experiências sustentam a possibilidade de que o Notch tem importância na regulação do IL-7R. • A via do IL-7R não influencia a diferenciação dos TLMPs mas proporciona sinais necessários para a sua proliferação e sobrevivência. IL-7Rα GM-CSFRα IL-2Rβ

13. A diferenciação final dos linfócitos T é induzida pelo microambiente do timo! Células do estroma

14. PI3K PI3K importante para o desenvolvimento e é regulador crítico da sobrevivência, crescimento e proliferação dos linfocitos. Via PI3K/Akt Hes1 mTorc Notch Intreferir com as funções do Hes1 afeta o desenvolvimento primordial e a expanção das células T e leva a um maior aparecimento de células não-T.

15. Checkpoint Beta Gene Rag1 e Rag2 Apoptose

16. Complexo pre-tcr • As DN3 que expressam o receptor TCRβ rearranjado e produtivo, juntamente com o pTα e CD3 formam o complexo pre-TCR que medeia a passagem pela β-selecção • Outras vias sinalizadoras mediadas por IL-7R e CXCR4 promovem a ativação da via PI3K/Akt demonstrados agirem juntamente com pre-TCR durante β-selecção • Hes1, PTEN e c-Myc moleculas chave para a sobrevivência, diferenciação e poliferação no checkpoint da β-selecção • Expressão aumentada de PTEN resulta na diminuição da capacidade de diferenciar e proseguir na β-selecção. • Notch é necessário para um correto rearranjo do gene TCRβ e activação das moleculas chave

17. cxcr4 Expressão descontinua ou ausente do Notch Notch A sinalização de CXCR4 assegura a sobrevivência dos timocitos via PI3K/Akt ou promove a sua apoptose pela via p38/MAPK.

18. C-Myc • No desenvolvimento das células T o c-Myc é descrito como mediador da proliferação. • A indução da expressão do c-Myc pelo Notch leva a proliferação das células que passaram a β-seleção e atingem o estado DP, estado no qual a sinalização Notch cessa para evitar o aparecimento de leucemias.

19. Leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) • Carateriza-se por um grande defeito de maturação, induzindo a um acúmulo de células imaturas e a uma falha na produção de células hematopoéticas diferenciadas. • Sendo assim, estas células imaturas não são capazes de desempenhar suas funções normais. • Apresentam mutações ativadoras no gene NOTCH1 em mais de 50% dos casos. • Sabe-se que a sinalização constitutiva de NOTCH em progenitores linfóides promove o desenvolvimento de células T imaturas. • Caracteriza-se pela presença de mutações envolvendo os genes que codificam os recetores de células T (TCR) e em vários genes de fatores de transcrição sendo o NOTCH1 o mais frequente.

20. Mutações do gene NOTCH1 • As mutações ativadoras de NOTCH1 normalmente interrompem os bloqueios moleculares responsáveis pela prevenção da ativação espontânea do recetor na membrana ou mediando o final da sinalização de NOTCH1 no núcleo. • Uma das mutações ocorre no domínio HD, promovendo instabilidade no recetor NOTCH1, que resulta na ativação independente do ligando, aumentando a libertação do ICN e sua consequente deslocação para o núcleo. • Pode ocorrer uma mutação na extremidade 3’ do gene onde está codificado o domínio PEST, que são responsáveis pela eliminação da sequência de reconhecimento para a degradação de ICN pelo complexo FBXW7/SCF no núcleo, assim há um aumento de ICN e uma acentuação da atividade do NOTCH1. • Em casos raros, NOTCH1 é ativado como resultado de inserções in-frame na parte distal do domínio HD, resultando no deslocamento e consecutivo processamento no local de clivagem da protéase ADAM10.

21. Mutações do gene FBXW7 • Podem ocorrer: • Mutações no gene FBXW7 , que normalmente envolvem resíduos de arginina, que são responsáveis pelo reconhecimento dos locais de fosforilação do domínio PEST do recetor NOTCH1. • Mutações duplas no domínio HD e PEST ou em HD e FBXW7. A presença de mutações nestes domínios induzem a ativação na membrana, independentemente do ligando, prejudicando a degradação do recetor ativo do núcleo, resultando em altos níveis de sinalização de NOTCH1.

22. Inibição do NOTCH através do péptido SAHM1 • No processo de ativação de NOTCH1, após a libertação do domínio intracelular (ICN), este vai para o núcleo e liga-se ao fator de transcrição CSL, que por sua vez vai recrutar o coativador MAML1 para que ocorra então a transcrição dos genes alvo de NOTCH1. • Recentemente foi desenvolvido um péptido que se liga ao complexo ICN-CSL, o SAHM1, que diretamente contraria o recrutamento de MAML1, bloqueando a transcrição dos genes alvo de NOTCH1 mesmo este estando ativo.

23. Mecanismo de inibição de SAHM1 • Parte A: Processo de ativação de NOTCH1 no núcleo, mostrando a ligação do fator de transcrição CSL e coactivador MAML1 ao ICN para ativação dos genes alvos. • Parte B: Inibição do processo pelo péptido SAHM1, que impede que a MAML1 se ligue ao complexo ICN-CSL, bloqueando a ativação dos genes alvos.

24. Inibidores gama-secretase (GSIs) • A inibição a partir de GSIs bloqueia a atividade do complexo gama-secretase, que é necessária para a clivagem do domínio intracelular de NOTCH. • A utilização de anticorpos que ligam no ligando Delta-Like-4, previne a ligação e a ativação de NOTCH a partir de ligandos. • A inibição por anticorpos específicos ao recetor NOTCH1, impede a clivagem proteolítica da região reguladora negativa, mesmo após a ativação pelo ligando.

25. Inibição por anticorpos específicos • Foram desenvolvidos anticorpos específicos para o recetor NOTCH1 e NOTCH2 • Estes anticorpos estabilizam a região reguladora negativa de NOTCH1 e NOTCH2 que está localizada na parte extracelular que por sua vez evita a clivagem do domínio intracelular mesmo na presença dos respetivos ligandos • Os anticorpos mostram inibição, dependente de dose, na sinalização in vitro de ambos os NOTCH e alta especificidade ao seu respetivo recetor • Os resultados deste anticorpo específico de NOTCH1 em linhas celulares de LLA-T (que contêm mutações em NOTCH1) demostram que existe inibição do crescimento celular em in vitro

26. Anticorpos específicos do ligando delta-like-4 • O ligando Delta-Like-4 (Dll4) contribui para a auto-renovação das stem cells e para o desenvolvimento vascular • Haploinsuficiênciade Dll4, resulta em letalidade embrionária devido a efeitos de desenvolvimento na vasculatura. • O bloqueio de Dll4 resulta na formação de uma vasculatura não funcional, incapaz de suportar o crescimento tumoral. • Os anticorpos específicos ao ligando DII4, funcionam de modo a prevenir a ligação de ligandos e subsequente ativação de NOTCH. • Obloqueio de Dll4/NOTCH1 poderia aumentar a eficácia de anti-VEGF em tumores sensíveis, podendo assim ter um potencial para aumentar os efeitos de quimioterapias.

27. Referência s Bibliográficas • Ferrando, A., The role of NOTCH1 signaling in T-ALL, Departments of Pediatrics and Pathology and Institute for Cancer Genetics, Columbia University Medical Center, New York, USA (2009) • Demarest, R., Dahmane, N., Capobianco, A., Notch is oncogenic dominant in T-cell acute lymphoblastic leukemia, Molecular Oncology Program, Division of Surgical Oncology, Miami, Dewitt Daughtry Family Department of Surgery and University of Miami Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, USA (2011) • Tosello, V., Ferrando, A., The NOTCH signaling pathway: role in the pathogenesis of T-cell acute lymphoblastic leukemia and implication for therapy, New York, Institute for Cancer Genetics, Columbia University Medical Center, NY, USA (2012) • Rizzo, P., Miele, L., Ferrari, R. The Notch pathway: a crossroad betweenthe life and death of the endothelium, Department of Cardiology and LTTA Centre, University Hospital of Ferrara, Ferrara, Salvatore Maugeri Foundation, IRCCS, Lumezzane, Italy, Cancer Institute, Ergon Professor of Medicine and Pharmacology, University of Mississippi Medical Center, Jackson MS, USA (2012)

28. Referência s Bibliográficas • Bailis, W., Pear, W., Notch and PI3K: how is the road traveled?, Niversity of Pennsylvania Perelman School of Medicine, Pennsylvania, USA (2012) • Varnum-Finney, B., Brashem-Stein, C., D. Bernstein, I., Combined effects of Notch signaling and cytokines induce a multiple log increase in precursors with lymphoid and myeloid reconstituting ability, The American Society of Hematology Introduction (2003) • García-Peydró, M., Yébenes, V., L Toribio, M., Notch1 and IL-7 Receptor Interplay Maintains Proliferation of Human Thymic Progenitors while Suppressing Non-T Cell Fates, The Journal of Immunology, J Immunology (2006) • Jaleco, A., Neves, H., Hooijberg, E., Gameiro, P., Clode, N., Haury, M., Henrique, D., Parreira, L., Differential Effects of Notch Ligands Delta-1 and Jagged-1 in Human Lymphoid Differentiation, Instituto de Histologia e Embriologia, Faculdade de Medicina de Lisboa, Lisboa, Portugal (2001) • Garcia, A.; Kandel, J. J. Notch: A key regulator of tumor angiogenesis and metastasis. HistolHistopathol (2012)

29. Fim!