Universidade Estadual de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena

1. Universidade Estadual de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena Separação e recuperação de bioprodutos Prof. Arnaldo Márcio Ramalho Prata

2. As etapas do processo fermentativo até o final da fermentação são denominadas linhaascendente ou “up stream” e a etapa de recuperação do produto e tratamentos de resíduos é chamada linha descendenteou “down stream”

3. Ar Esterilização Esquema geral do processo fermentativo Preparo de inóculo (microrganismo) • Preparo do meio • tratamento da matéria-prima • mistura de nutrientes • ajuste de pH • tratamento térmico Fermentação propriamente dita (BIORREATOR) Linha ascendente Processos à montante “upstream” Recuperação do produto Tratamentos de resíduos Linha descendente Processos à jusante “downstream” Produto

4. SEPARAÇÃOE RECUPERAÇÃODEBIOPRODUTOS

5. Definição: Separação do produto do meio fermentado, colocando-o na forma mais pura possível para a aplicação a que se destina. • A etapa de recuperação de produto começa após a determinação correta do final da fermentação. • Esta deve levar em conta o máximo da produção técnica e a máxima produção econômica. • O produto de interesse pode estar no interior da célula ou no meio de fermentação (lembrar que há situações especiais).

6. Serão abordados os procedimentos envolvidos na recuperação de bioprodutos do tipo insumos químicos e biomoléculas e microrganismos, exemplificados a seguir: SEPARAÇÃOE RECUPERAÇÃODEBIOPRODUTOS Insumos químicos e biomoléculas Álcoois Polímeros Ácidos orgânicos Vitaminas Solventes Aminoácidos Antibióticos Enzimas Hormônios Poliésteres

7. Microrganismos • Inóculo para processos fermentativos • Microrganismos fixadores de nitrogênio • Microrganismos para controle biológico • Vacinas • Probióticos Exemplos de enzimas Protease de BacillusGlicose oxidase Amilase de Bacillus Invertase Glicoamilase Lisozima Glicose-isomerase Penicilina acilase Renina microbiana Lactase -amilase Lipase Amilase fúngicaXilanase

8. É importante observar a escala de aplicação dos diversos métodos de separação e purificação de produtos biotecnológicos: • Escala de laboratório, normalmente para produtos destinados a estudos acadêmicos e aplicações específicas • Escala industrial, quando se busca a obtenção de grandes quantidades de produto para fins comerciais

9. SEPARAÇÃOE RECUPERAÇÃODEBIOPRODUTOS

10. Purificação de bioprodutos

11. Processamento Upstream

12. Separação e purificação de bioprodutos

16. Operações envolvidas no processo de purificação de bioprodutos

18. Separação das células suspensas de um meio fermentado • Operações unitárias viáveis em escala industrial: • Filtração convencional • Filtração tangencial • Centrifugação Clarificação A operação unitária adequada depende da faixa de dimensão da partícula a ser removida:

19. Separação das células suspensas no meio fermentado Filtração Clarificação

20. Filtração Convencional Clarificação Aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células, produtos extracelulares e situações que não necessitam de assepsia.

21. Princípio de separação Filtração: tamanho da partícula (também forma e compressibilidade do material) • A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente direcionada a um meio filtrante (filtração convencional). • Aplica-se a suspensões diluídas de células. • “A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é denominada filtradoe o depósito de sólidos (sobretudo células) sobre o meio filtrante chama-se torta.” • Alguns tipos de filtro: 1. Rotatório (mais adequado para meios biológicos, pois não é afetado pela compressibilidade da torta) 2. De pressão 3. Folha (disco) horizontal

22. Filtração Convencional Equipamento utilizado: Filtro Rotativo a Vácuo (FRV) Clarificação • O tambor fica parcialmente submerso em um recipiente que contém a suspensão. • Ocorre leve agitação para evitar a sedimentação. • Suspensão é alimentada pela parte externa do tambor. • A redução de pressão (vácuo), ocorre no interior do tambor, promovendo a filtração (formação da torta). • Tambor oco e rotativo (1 rpm), coberto com uma malha metálica filtrante, recoberta com terra diatomácea. • Capacidade de 0,1 a 0,2 m3.h

23. Filtração Tangencial: Microfiltração A tensão de cisalhamento do fluído minimiza o acúmulo de células e seus fragmentos na superfície das membranas. Clarificação O fluxo de filtrado e o coeficiente de retenção de solutos ou sólidos são influenciados pela formação de um gradiente de concentração de células ou solutos próximos à superfície da membrana e fouling Fluidos de alimentação escoam tangencialmente à superfície filtrante. A formação do gradiente de concentração é reversível com a alteração das condições de operação do processo, enquanto o fouling necessita de controle de escoamento e pressão.

24. Filtração Tangencial: Microfiltração • Membrana de fibra oca • Possuem elevada área filtrante por unidade de filtro. • Bastante susceptíveis à entupimentos. Clarificação • Membrana tipo placa e quadro • Possuem pequenas áreas filtrantes por unidade de volume. • Podem ser aplicados em regime turbulento. • A limpeza é fácil.

25. Esquema de um Filtro de Pressão

26. Fatores que influenciam a velocidade de filtração - permeabilidade de leito (K) - área de filtração (A) - viscosidade do líquido () - espessura do leito (L) - resistência do leito de filtração (L/K) - compressibilidade da torta (S) - concentração celular do líquido (X) - diferença de pressão através do leito (P) - const. relacionada a tamanho e forma das células (’)

27. O tempo (t) necessário para a filtração de um volume Vde suspensão contendo células sujeitas à compres-sibilidade, sob uma determinada pressão e através de uma área A é dado por: 2 . P(1-S) A2  . ’ . X V2 t = Obs.: - S varia de 0 a 1,0 - Tortas de células microbianas podem ter S de até 0,8 - Para tortas rígidas, S = 0

28. Clarificação Centrifugação A centrifugação de meios fermentados é uma tecnologia já consolidada. Suas vantagens sobre o processo de filtração são:

29. Centrifugação Princípio de separação: diferença de densidade (também tamanho de partícula e viscosidade) Clarificação Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo gravitacional centrifugo Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na viscosidade do meio líquido, na força motriz e a distância radial desde o centro da centrifuga até a célula e no diâmetro da particula.

30. Alguns tipos de centrífuga a) Tubular; b) Câmara; c) Disco; d) Rolo

31. Centrifuga tubular Clarificação • Podem operar sob refrigeração (13.000 a 17.000 x g) • Capacidade limitada de volume Aplica-se em suspensões de no máximo 30 g/L de células

32. Centrífuga tubular de alta velocidade

33. Centrifuga de disco Aplica-se em suspensões de no máximo 250 g/L de células Clarificação • Atuam em valores menores de centrifugação (5.000 a 15.000 x g) • Permite processamento continuo de 200 m3/h • Discos aumentam a área de sedimentação e reduzem o tempo necessário para centrifugação https://www.youtube.com/watch?v=dxTT_bP6IwI

34. Centrífuga de rolo (decanter) https://www.youtube.com/watch?v=FhS5vN4r5LA https://www.youtube.com/watch?v=w1E452YD1zw https://www.youtube.com/watch?v=jGwBpGELngk

35. Fatores de aceleração das centrífugas mais comuns Ultracentrífugas 105 – 106 x g Centrífugas tubulares 13000 – 17000 x g Centrífugas de câmara 6000 - 11000 x g Centrífugas de disco 5000 - 15000 x g Centrífugas de rolo 1500 – 4500 x g Critério para ampliação: Fator de aceleração . tempo ==> . t Se uma separação satisfatória é atingida com 3000xg durante 5 minutos, o mesmo resultado pode ser alcançado com 1500xg e 10 minutos, em escala industrial.

36. Obs.: Ultracentrífugas operam descontinuamente e normalmente têm baixa capacidade de processamento O fluxo volumétrico de alimentação para uma centrífuga pode ser determinado pela expressão: Q = d2 . . g. . A 18  Onde: Q é o fluxo volumétrico de alimentação  é a diferença de densidade (dens. Sólido – dens. do líquido) g é a aceleração da gravidade d é o diâmetro da partícula  é o fator de aceleração A é o equivalente de área do rotor  é a viscosidade dinâmica do líquido

37. Cálculo de “g”: N2 . R g = 89500 Onde: N é a velocidade ou frequência de rotação do eixo (rpm) R é o raio da circunferência (cm) Raio: distância entre o centro do eixo e o fundo do tubo ou da câmara de sedimentação

38. Exemplo de aplicação para centrífuga Uma determinada indústria apresenta uma produção de meio fermentado igual a 180 m3/dia. (a) Considerando as características do meio e da centrífuga a ser empregada, quantas unidades deste equipamento você solicitaria ao departamento de compras da empresa, de modo a garantir a separação das células do meio de fermentação, sem risco de parar a produção? (b) Considere, agora, que foi estabe-lecido que serão compradas 8 centrífugas com equivalente de área igual a 0,10 m2. Qual deve ser o fator de aceleração destas centrífugas? Dados: Densidade do sólido = 1000 kg/m3 Densidade do líquido = 900 kg/m3 Viscosidade do líquido = 10-2 kg/m.s Diâmetro da partícula = 0,01 mm Fator de aceleração = 8000 Equivalente de área = 0,10 m2 Q = d2 .  . g .  . A 18 . 