1 / 70

Nukleové kyseliny Organizace genomu

Nukleové kyseliny Organizace genomu. David Kaftan, 2014. Nukleové kyseliny. DNA, RNA, centrální dogma DNA struktura Watson , Crick 1953, nobelova cena 1962 báze, nukleosidy, nukleotidy primární- komplementarita bazí sekundární- dvoušroubovice terciární replikace reparace mutace

clio-shields
Download Presentation

Nukleové kyseliny Organizace genomu

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Nukleové kyselinyOrganizace genomu David Kaftan, 2014

  2. Nukleové kyseliny • DNA, RNA, centrální dogma • DNA • struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962 • báze, nukleosidy, nukleotidy • primární- komplementarita bazí • sekundární- dvoušroubovice • terciární • replikace • reparace • mutace • RNA • struktura • jednošroubovicová • mRNA a hnRNA • tRNA • rRNA • snRNA • transkripce a úpravy RNA • translace-proteiny

  3. DNA a RNA jsou polymerypurinových a pyrimidinových nukleotidů • dlouhé, nerozvětvené polymery • monomer – nukleotid • purinová nebo pyrimidinová báze • pentosový cukr • fosfátová skupina • DNA • 2-deoxyribóza • purin: adenine, guanine • pyrimidin: cytosin, thymin • RNA • ribóza • přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní • purin: adenine, guanine • pyrimidin: cytosine, uracyl

  4. De-novo syntéza pyrimidinů • CO2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu • kyselina orotová + fosforibosylpyrofosfát (PRPP) • uridine TP • cytidin TP • syntéza v plastidech • UMP • udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do DNA • dTMP • dUMP + methenylhydrofolate • metylace, deaminace dCDP (Lemna major)

  5. De-novo syntéza purinů • syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním • uhlíků • glycin • CO2 • formyl a methenyltetrahydrofolát (THF) • amidové skupiny • kyselina asparagová • glutamin • syntéza v cytosolu

  6. Katabolismus a recyklace nukleotidů báze + PRPP  ribonukleotid + PPi báze + (deoxy)ribóza 1-P  (deoxy)nukleosid + Pi (deoxy)nukleosid + ATP (deoxy)nukleotid + ATP • hydrolýza DNA, RNA • oligonukleotidy • mononukleotidy • nukleosidy, báze • syntéza • jednostupňová • reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy • dvoustupňová • nereverzibilní

  7. Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů • kovalentní fosfodiesterová vazba • fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů • dva funkční konce • 3‘ • volná hydroxylová skupina • 5‘ • volná fosfátová skupina

  8. Párování bazí v DNA • převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice • jedna otočka za 3.4 nm • 10.1 párů bazí na otočku • flexibilní • vodíkové vazby mezi vlákny • chybí vazby mezi „patry“ • A – T • dvě vodíkové vazby • G – C • tři vodíkové vazby • párování hnáno zvýšením entropie • vznik dvouvlákna snižuje entropii • hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie

  9. Alternativní struktury DNA • B forma • nejčastější • A DNA • dehydratovaná forma • RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice • in vitro, ale i v buňkách • Z DNA • levotočivá šroubovice • střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C

  10. DNA v jádře je organizována v chromozómech • DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny • histony • malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu • vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA • nehistonové proteiny • chromatin • nukleosom • dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů • H2A, H2B, H3, H4 • solenoid • stabilizován histonem H1

  11. replikace DNA je semikonzervativní

  12. Replikace jaderné DNA • počátek obsahuje charakteristickou sekvenci • kvasinky – 200 bp • savci – počátky i 10 kbp od sebe • rostliny – není známo • iniciace, elongace, terminace • S fáze buněčného cyklu • iniciace zahájena na několika místech současně • v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby) • replikon • celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku • 50-70 kb • rychlost replikace • baktérie 1000 nukleotidů za sekundu • eukaryota 100 nukleotidů za sekundu • ukončení replikace při setkání vidliček

  13. Replikace DNA: replikační počátky

  14. Replikace jaderné DNA • oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T • vazba proteinů specifických pro replikaci • DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání dvoušroubovice • replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA • DNA topoizomeráza rozplétá smyčky • Primáza • syntéza krátkých segmentů RNA komplementární s DNA • DNA polymeráza • připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

  15. DNA polymeráza • připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA • kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP • nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce • podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě • Okazakiho fragmenty • každý má svůj primer (asi 10 bazí) • dodatečně pospojovány ligázou • leadingstrand - kontinuálně rostoucí řetězec • 1 primer • laggingstrand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec

  16. DNA polymeráza • připojování nukleotidů jen za primerem • 3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA • α • nesyntetizuje dlouhé fragmenty • 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu • postrádá exonukleázovou aktivitu • , ε • spojeno s PCNA • dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů • RNAza H • odstraňuje RNA primer záměnou za DNA • ligáza • spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu

  17. RPA, PCNA • replikační protein A (RPA) • heterotrimerní struktura • stabilizace jednovláknové DNA • uvolněny Polα a Pol • proliferating cell nuclear antigen (PCNA) • homotrimerní struktura • spojen s Pol a replikačním faktorem(Rfc)

  18. DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci • připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování • frekvence chyb 1:107bp • polymeráza ve směru 5‘-3‘ • nukleáza ve směru 3‘-5‘ • proofreading • nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru

  19. DNA mismatchrepair • snižuje chybovost 1:107zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:109) • rozeznání chyby • vyštěpení chybné oblasti • jedna baze • celý úsek nemetylované DNA • DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec • ligáza napojí fragmenty

  20. Změny ve struktuře DNA • spontánní depurinace • deaminace cytosinu • 100 bazí za den a genom • thymidinový dimer - UV záření • alkylace guaninu • stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů • většina změn v nekódujících sekvencích

  21. Oprava pyrimidinových dimerů • dimer indukováno UV světlem • oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem • fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer • excisionrepair

  22. Post-replikační oprava • DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem • pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bpdownstream) • homologní rekombinace s komplementárním vláknem • vyplnění chybějících částí DNA polymerázami • napojení segmentů ligázami

  23. Homolognírekombince • opravy – uchování nezměněné DNA • meióza – zdroj variability • nové kombinace DNA • nové geny, RNA, proteiny • odlišné gamety • mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů • poměrně časté • reciproké vs. genová konverze

  24. Homologní rekombinace: single-strandannealing • extrachromozomální • plazmidová DNA • T-DNA • přerušení obou vláken obou duplexů • exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí jednovláknovýhomologní úsek • komplementární úseky jsou přiloženy (annealing) • odstranění nehomologních částí • oprava mezer • nekonzervativní – jen jeden duplex přežije

  25. Homologní rekombinace: double-strandbreakrepair • meióza • přerušení dvou vláken jednoho z duplexů • přerušení rozšířeno endonukleázami • 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexukde slouží jako primery • ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy

  26. Homologní rekombinace: přenos vlákna • LIM15 (homolog RecA) • synaptonemální komplex

  27. Homologní rekombinace: one-sidedinvasion • krátké (žádné) homologní sekvence • u rostlin častější než ostatní typy rekombinace • traspozonní elementy • vmezeření T-DNA • přerušení obou vláken akceptorového duplexu • přerušení rozšířeno exonukleázami • jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního duplexu • prodloužení invadujícího vlákna

  28. Telomery • koncové sekvence chromozómů • konzervované repetitivní sekvence • telomeráza • obsahuje RNA • rozeznává terminální sekvenci bohatou na G • opakovaně přidává repetitivní sekvence na konec telomery

  29. Plastidy jsou endosymbionty • DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích

  30. Plastidová DNA • kruhový chromozóm • velký segment • malý segment • invertovaný opakující se segment • chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas • tandemové opakování rRNA • Euglenagracilis • rozdílné délky • Codium - 89 kb • Acetabularia - 400 kb • vyšší rostliny obvykle 120-160 kb • invertovaný segment: 0.5-76 kb

  31. Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny • kolem 100 genů • většinou všechny rRNA, tRNA • klíčové geny pro enzymy fotosyntézy • nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů • 50-73 kb, cca 40 genů • řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře

  32. Mechanismus replikace plastidové DNA • mnoho kopií • až 150 • počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu • frekvence replikace • nezávislá na buněčném dělení u diferencujících se buněk • synchronní u rychle dělících se buněk • replikační počátky poblíž rRNA genů • v invertovaných oblastech u tabáku • pravděpodobně i další replikační počátky • všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře • helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy, primázy

  33. Mitochondriální DNA • velká variabilita velikostí • Oenothera, Brassica: 200 kb • Cucumis melo: 2600 kb • rozsáhlé nekódující sekvence • Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb • neobsahují opakující se sekvence • živočišné mitochondrie mají malý kompaktní genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí • lineární • Chlamydomonas • cirkulární • jeden kruhový chromozom • Marchantia, Brassica • mnoho subgenomických kruhových chromozómů

  34. Homologní rekombinace subgenomických chromozómů • dynamika master cycle – subgenomiccycle • rekombinace opakujících se sekvencích • 2 isoformy • 2 subgenomické cykly • 3 kombinace subgenomickýchcyklů

  35. Mitochondriální genom • malý počet genů • oxidativní respirace • syntéza ATP • translace

  36. Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií • promiskuitní DNA • obsažena ve více kopiích • jádro, mitochondrie, chloroplasty • rostliny, živočichové, houby • není jen jednosměrný transfer • plastidy-jádro, jádro-plastidy • plastidový ribozomální protein rpl23 • nahrazen jaderným po inaktivaci původního plastidového • chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23 • přenos z chloroplastu do mitochondrií • jednosměrný • mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA

  37. Transkripce DNA - geny • gen • kódován DNA • kóduje protein • protein • DNA - aminokyselina • sekvence aminokyselin -protein • trojrozměrná struktura určuje funkci • DNA kód • 4-písmenná abeceda (A,G,C,T) • kódující část genu • menší část • nekódující část • kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat • genom • kompletní genetická informace DNA organismu

  38. Organizace plastidového genomu • operon • sekvence bakteriálních genů podobného typu transkribovaných najednou • polycistronní transktipt • klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné • monocistronnítranskript • jeden transkript a jeden gen • introny • nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci • exony • kódující sekvence

  39. Organizace jaderného genomu • asi jen 1 % DNA je transkribováno • počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná • gen • promotor • transkribovaná oblast • exony • introny • 3‘ konec nesoucí regulační funkce

  40. Organizace jaderného genomu • příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně • umístění na chromozómu • odděleně • v klastrech, často opakujících se • histony: 10-600x • rRNA:

  41. Transposableelements • mobilní DNA sekvence • mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu • transposonyretrotransposony

  42. Bakteriální transposableelements • vložené sekvence (insertionsequenceelements) • invertedrepeat • 5‘ GAGC-----GCTC 3‘ • 3‘ CTCG-----CGAG 5‘ • 1-2 kb • mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu • přesun více méně náhodný • přesun jen DNA • poměrně vzácně • 1:105-107 buněk

  43. RNA: primární struktura • lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů • adenin, guanin, citosin, uracyl • fosforylovaná ribóza • párování s DNA • A-U, T-A, G-C, ale také G-U • méně stabilní než DNA • volný 2‘ hydroxyl ribózy • heteropolární řetězec • 5‘ začátek • 3‘ konec • častá katalytická aktivita • váha – S • sedimentační koeficient • Svedberg

  44. Sekundární struktura RNA • většina tvořena jednotlivými vlákny • lokální sekundární struktura • smyčky, vlásenky • výduť • standardní párování • G – C, A – U • nestandardní párování • G – U, U – U, G – A • volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje vodíkovou vazbu k interakcím • interakce domén vytváří terciální struktury

  45. RNA je méně stabilní než DNA • 2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní • RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu • při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu

  46. Prekurzorová a mediátorová RNA • mRNA – messenger (mediátorová, informační) • kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů • (1-2% celkové buněčné RNA) • nejméně stabilní • hnRNA - heterogenní nukleová • pre-mRNA - prekurzorovámRNA vzniklá v jádře, tzv. primární transkript • delší než samotný strukturní gen • různé oblasti DNA • exony (kódujicí) • introny (nekódujicí) • působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA

  47. Transferová RNA • tRNA – transferová (přenosová) • přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na ribosom • většina 4S RNA • mitochondrie • chybí většina celého setu • import s cytoplazmy • chloroplasty • obvykle soběstačné • paraziti importují z cytoplazmy • cytoplazma

  48. Ribosomální RNA • rRNA – ribosomální • součást ribozomu • malá podjednotka • velká podjednotka • 3 typy ribozomů • cytoplasmatické • plastidové • mitochondriální

  49. malé RNA • malé RNA • účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER • snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA • RNA splicing: U1, U2 ,U4-9, U11, U12 • úprava 3‘ histonové mRNA: U7 • snoRNA – malé jadérkové RNA • prerRNAprocessing • scRNA – malé cytoplasmatické RNA • cRNA – chromosomová RNA • miRNA – mikro RNA • regulace a stabilita translace mRNA • telomerázová RNA • templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů • 7SL RNA • import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula

  50. Genetická informace kódovaná v RNA • virus tabákové mozaiky • jednovláknová RNA • proteinový kabátek kódován RNA • Gierer a Schramm 1956 • samotná RNA způsobuje infekci • Fraenkel-Conrat, Singer 1957 • hybridní virové částice • RNA a cizí protein • nové virové částice obsaohvaly vlastní protein

More Related