710 likes | 997 Views
Nukleové kyseliny Organizace genomu. David Kaftan, 2014. Nukleové kyseliny. DNA, RNA, centrální dogma DNA struktura Watson , Crick 1953, nobelova cena 1962 báze, nukleosidy, nukleotidy primární- komplementarita bazí sekundární- dvoušroubovice terciární replikace reparace mutace
E N D
Nukleové kyselinyOrganizace genomu David Kaftan, 2014
Nukleové kyseliny • DNA, RNA, centrální dogma • DNA • struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962 • báze, nukleosidy, nukleotidy • primární- komplementarita bazí • sekundární- dvoušroubovice • terciární • replikace • reparace • mutace • RNA • struktura • jednošroubovicová • mRNA a hnRNA • tRNA • rRNA • snRNA • transkripce a úpravy RNA • translace-proteiny
DNA a RNA jsou polymerypurinových a pyrimidinových nukleotidů • dlouhé, nerozvětvené polymery • monomer – nukleotid • purinová nebo pyrimidinová báze • pentosový cukr • fosfátová skupina • DNA • 2-deoxyribóza • purin: adenine, guanine • pyrimidin: cytosin, thymin • RNA • ribóza • přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní • purin: adenine, guanine • pyrimidin: cytosine, uracyl
De-novo syntéza pyrimidinů • CO2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu • kyselina orotová + fosforibosylpyrofosfát (PRPP) • uridine TP • cytidin TP • syntéza v plastidech • UMP • udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do DNA • dTMP • dUMP + methenylhydrofolate • metylace, deaminace dCDP (Lemna major)
De-novo syntéza purinů • syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním • uhlíků • glycin • CO2 • formyl a methenyltetrahydrofolát (THF) • amidové skupiny • kyselina asparagová • glutamin • syntéza v cytosolu
Katabolismus a recyklace nukleotidů báze + PRPP ribonukleotid + PPi báze + (deoxy)ribóza 1-P (deoxy)nukleosid + Pi (deoxy)nukleosid + ATP (deoxy)nukleotid + ATP • hydrolýza DNA, RNA • oligonukleotidy • mononukleotidy • nukleosidy, báze • syntéza • jednostupňová • reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy • dvoustupňová • nereverzibilní
Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů • kovalentní fosfodiesterová vazba • fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů • dva funkční konce • 3‘ • volná hydroxylová skupina • 5‘ • volná fosfátová skupina
Párování bazí v DNA • převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice • jedna otočka za 3.4 nm • 10.1 párů bazí na otočku • flexibilní • vodíkové vazby mezi vlákny • chybí vazby mezi „patry“ • A – T • dvě vodíkové vazby • G – C • tři vodíkové vazby • párování hnáno zvýšením entropie • vznik dvouvlákna snižuje entropii • hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie
Alternativní struktury DNA • B forma • nejčastější • A DNA • dehydratovaná forma • RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice • in vitro, ale i v buňkách • Z DNA • levotočivá šroubovice • střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C
DNA v jádře je organizována v chromozómech • DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny • histony • malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu • vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA • nehistonové proteiny • chromatin • nukleosom • dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů • H2A, H2B, H3, H4 • solenoid • stabilizován histonem H1
Replikace jaderné DNA • počátek obsahuje charakteristickou sekvenci • kvasinky – 200 bp • savci – počátky i 10 kbp od sebe • rostliny – není známo • iniciace, elongace, terminace • S fáze buněčného cyklu • iniciace zahájena na několika místech současně • v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby) • replikon • celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku • 50-70 kb • rychlost replikace • baktérie 1000 nukleotidů za sekundu • eukaryota 100 nukleotidů za sekundu • ukončení replikace při setkání vidliček
Replikace jaderné DNA • oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T • vazba proteinů specifických pro replikaci • DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání dvoušroubovice • replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA • DNA topoizomeráza rozplétá smyčky • Primáza • syntéza krátkých segmentů RNA komplementární s DNA • DNA polymeráza • připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA
DNA polymeráza • připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA • kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP • nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce • podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě • Okazakiho fragmenty • každý má svůj primer (asi 10 bazí) • dodatečně pospojovány ligázou • leadingstrand - kontinuálně rostoucí řetězec • 1 primer • laggingstrand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec
DNA polymeráza • připojování nukleotidů jen za primerem • 3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA • α • nesyntetizuje dlouhé fragmenty • 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu • postrádá exonukleázovou aktivitu • , ε • spojeno s PCNA • dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů • RNAza H • odstraňuje RNA primer záměnou za DNA • ligáza • spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu
RPA, PCNA • replikační protein A (RPA) • heterotrimerní struktura • stabilizace jednovláknové DNA • uvolněny Polα a Pol • proliferating cell nuclear antigen (PCNA) • homotrimerní struktura • spojen s Pol a replikačním faktorem(Rfc)
DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci • připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování • frekvence chyb 1:107bp • polymeráza ve směru 5‘-3‘ • nukleáza ve směru 3‘-5‘ • proofreading • nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru
DNA mismatchrepair • snižuje chybovost 1:107zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:109) • rozeznání chyby • vyštěpení chybné oblasti • jedna baze • celý úsek nemetylované DNA • DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec • ligáza napojí fragmenty
Změny ve struktuře DNA • spontánní depurinace • deaminace cytosinu • 100 bazí za den a genom • thymidinový dimer - UV záření • alkylace guaninu • stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů • většina změn v nekódujících sekvencích
Oprava pyrimidinových dimerů • dimer indukováno UV světlem • oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem • fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer • excisionrepair
Post-replikační oprava • DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem • pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bpdownstream) • homologní rekombinace s komplementárním vláknem • vyplnění chybějících částí DNA polymerázami • napojení segmentů ligázami
Homolognírekombince • opravy – uchování nezměněné DNA • meióza – zdroj variability • nové kombinace DNA • nové geny, RNA, proteiny • odlišné gamety • mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů • poměrně časté • reciproké vs. genová konverze
Homologní rekombinace: single-strandannealing • extrachromozomální • plazmidová DNA • T-DNA • přerušení obou vláken obou duplexů • exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí jednovláknovýhomologní úsek • komplementární úseky jsou přiloženy (annealing) • odstranění nehomologních částí • oprava mezer • nekonzervativní – jen jeden duplex přežije
Homologní rekombinace: double-strandbreakrepair • meióza • přerušení dvou vláken jednoho z duplexů • přerušení rozšířeno endonukleázami • 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexukde slouží jako primery • ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy
Homologní rekombinace: přenos vlákna • LIM15 (homolog RecA) • synaptonemální komplex
Homologní rekombinace: one-sidedinvasion • krátké (žádné) homologní sekvence • u rostlin častější než ostatní typy rekombinace • traspozonní elementy • vmezeření T-DNA • přerušení obou vláken akceptorového duplexu • přerušení rozšířeno exonukleázami • jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního duplexu • prodloužení invadujícího vlákna
Telomery • koncové sekvence chromozómů • konzervované repetitivní sekvence • telomeráza • obsahuje RNA • rozeznává terminální sekvenci bohatou na G • opakovaně přidává repetitivní sekvence na konec telomery
Plastidy jsou endosymbionty • DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích
Plastidová DNA • kruhový chromozóm • velký segment • malý segment • invertovaný opakující se segment • chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas • tandemové opakování rRNA • Euglenagracilis • rozdílné délky • Codium - 89 kb • Acetabularia - 400 kb • vyšší rostliny obvykle 120-160 kb • invertovaný segment: 0.5-76 kb
Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny • kolem 100 genů • většinou všechny rRNA, tRNA • klíčové geny pro enzymy fotosyntézy • nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů • 50-73 kb, cca 40 genů • řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře
Mechanismus replikace plastidové DNA • mnoho kopií • až 150 • počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu • frekvence replikace • nezávislá na buněčném dělení u diferencujících se buněk • synchronní u rychle dělících se buněk • replikační počátky poblíž rRNA genů • v invertovaných oblastech u tabáku • pravděpodobně i další replikační počátky • všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře • helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy, primázy
Mitochondriální DNA • velká variabilita velikostí • Oenothera, Brassica: 200 kb • Cucumis melo: 2600 kb • rozsáhlé nekódující sekvence • Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb • neobsahují opakující se sekvence • živočišné mitochondrie mají malý kompaktní genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí • lineární • Chlamydomonas • cirkulární • jeden kruhový chromozom • Marchantia, Brassica • mnoho subgenomických kruhových chromozómů
Homologní rekombinace subgenomických chromozómů • dynamika master cycle – subgenomiccycle • rekombinace opakujících se sekvencích • 2 isoformy • 2 subgenomické cykly • 3 kombinace subgenomickýchcyklů
Mitochondriální genom • malý počet genů • oxidativní respirace • syntéza ATP • translace
Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií • promiskuitní DNA • obsažena ve více kopiích • jádro, mitochondrie, chloroplasty • rostliny, živočichové, houby • není jen jednosměrný transfer • plastidy-jádro, jádro-plastidy • plastidový ribozomální protein rpl23 • nahrazen jaderným po inaktivaci původního plastidového • chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23 • přenos z chloroplastu do mitochondrií • jednosměrný • mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA
Transkripce DNA - geny • gen • kódován DNA • kóduje protein • protein • DNA - aminokyselina • sekvence aminokyselin -protein • trojrozměrná struktura určuje funkci • DNA kód • 4-písmenná abeceda (A,G,C,T) • kódující část genu • menší část • nekódující část • kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat • genom • kompletní genetická informace DNA organismu
Organizace plastidového genomu • operon • sekvence bakteriálních genů podobného typu transkribovaných najednou • polycistronní transktipt • klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné • monocistronnítranskript • jeden transkript a jeden gen • introny • nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci • exony • kódující sekvence
Organizace jaderného genomu • asi jen 1 % DNA je transkribováno • počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná • gen • promotor • transkribovaná oblast • exony • introny • 3‘ konec nesoucí regulační funkce
Organizace jaderného genomu • příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně • umístění na chromozómu • odděleně • v klastrech, často opakujících se • histony: 10-600x • rRNA:
Transposableelements • mobilní DNA sekvence • mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu • transposonyretrotransposony
Bakteriální transposableelements • vložené sekvence (insertionsequenceelements) • invertedrepeat • 5‘ GAGC-----GCTC 3‘ • 3‘ CTCG-----CGAG 5‘ • 1-2 kb • mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu • přesun více méně náhodný • přesun jen DNA • poměrně vzácně • 1:105-107 buněk
RNA: primární struktura • lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů • adenin, guanin, citosin, uracyl • fosforylovaná ribóza • párování s DNA • A-U, T-A, G-C, ale také G-U • méně stabilní než DNA • volný 2‘ hydroxyl ribózy • heteropolární řetězec • 5‘ začátek • 3‘ konec • častá katalytická aktivita • váha – S • sedimentační koeficient • Svedberg
Sekundární struktura RNA • většina tvořena jednotlivými vlákny • lokální sekundární struktura • smyčky, vlásenky • výduť • standardní párování • G – C, A – U • nestandardní párování • G – U, U – U, G – A • volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje vodíkovou vazbu k interakcím • interakce domén vytváří terciální struktury
RNA je méně stabilní než DNA • 2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní • RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu • při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu
Prekurzorová a mediátorová RNA • mRNA – messenger (mediátorová, informační) • kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů • (1-2% celkové buněčné RNA) • nejméně stabilní • hnRNA - heterogenní nukleová • pre-mRNA - prekurzorovámRNA vzniklá v jádře, tzv. primární transkript • delší než samotný strukturní gen • různé oblasti DNA • exony (kódujicí) • introny (nekódujicí) • působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA
Transferová RNA • tRNA – transferová (přenosová) • přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na ribosom • většina 4S RNA • mitochondrie • chybí většina celého setu • import s cytoplazmy • chloroplasty • obvykle soběstačné • paraziti importují z cytoplazmy • cytoplazma
Ribosomální RNA • rRNA – ribosomální • součást ribozomu • malá podjednotka • velká podjednotka • 3 typy ribozomů • cytoplasmatické • plastidové • mitochondriální
malé RNA • malé RNA • účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER • snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA • RNA splicing: U1, U2 ,U4-9, U11, U12 • úprava 3‘ histonové mRNA: U7 • snoRNA – malé jadérkové RNA • prerRNAprocessing • scRNA – malé cytoplasmatické RNA • cRNA – chromosomová RNA • miRNA – mikro RNA • regulace a stabilita translace mRNA • telomerázová RNA • templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů • 7SL RNA • import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula
Genetická informace kódovaná v RNA • virus tabákové mozaiky • jednovláknová RNA • proteinový kabátek kódován RNA • Gierer a Schramm 1956 • samotná RNA způsobuje infekci • Fraenkel-Conrat, Singer 1957 • hybridní virové částice • RNA a cizí protein • nové virové částice obsaohvaly vlastní protein