魏岱旭 2009-04-29

工业微生物近期动态 魏岱旭 2009-04-29

摘要 • 大多数目前的生物技术应用的来源是微生物。 • 全球的最终目标提供新的可用物质的形成了微生物来源的市场。 • 然而，直接分离出微生物总是显示出：大多数是不能被很好的培养（没有经济的高效的培养基）。 • 因此，从新的微生物或基因组，或从自己的菌落得到信息，将构成一个巨大的潜力，提供行业新产品和工艺的基础上利用微生物资源，促进和扩大基本知识的有机体。 • 本文章举出了一些关于微生物的遗传库的实例和进展探索在微生物工业的应用。

微生物是最丰富的基因来源 • 微生物是地球上活的有机体中所占分量最大。 • 在总生物细胞数【total biomass cell numbers】： 6×1030 的细菌, 1.3× 1028的古细菌， 3.1×1029的真核细菌。 • 生物量【cell biomass】： 6×1018 kg的细菌, 1.3×1016 kg的古细菌， 3.1×1017 kg的真核细菌, 平均是1 pg/ 细胞 • 多样性

微生物的基因研究现状 • 收获和利用新的生物产品和活动的微生物多样性的应用范围是目前主要的进展情况，并提供技术解决方案。但是，基本的和工业微生物学的研究已主要集中于约6500种微生物记录。 • 来自于 762个完整基因组（ 50 %明显具有生物技术的潜力）已经发表，并有2773个正在进行的测序项目（89种古细菌，1749种细菌，和935种真核细胞），这将构成一个宝贵的资料。 • 这篇文章审查的重点是迄今所使用的战略，探索，改进和实施生化多功能的微生物在工业运用。

“微生物的作用选择像点菜一样简单” 大背景： • 纯培养的微生物已经成功使用超过100年。它们的经济潜力仍然是巨大的：其年度增值的化工行业本身是10亿美元，并在未来10年内，60％的合成精细化学品将依靠微生物转换，发酵合成。 • 工业应用，一个应该考虑问题是，工业微生物自主复制催化剂，这在许多情况下可能低细胞密度和容积效率（活动每发酵体积）和高干扰酶活动，但是对于工业生产来说有一个非常严重的缺点，因为‘不想要’的生物量是浪费。 • 从环境方面，例如，溶剂，发酵空间，高压，高或低的温度或盐分，微生物或其酶可以在亚环境下执行。

“微生物的作用选择像点菜一样简单” 策略：利用四种不同的战略来提高微生物的性能，根据初级目标。 • 第一，得到并筛选可以通过系统生物学的方法进一步改良和利用的野生型微生物。 • 第二，合理的设计蛋白质工程酶，这可以进一步优化微生物工作所适当的有关理想物理化学条件的工业过程。 • 第三，结合不同的遗传途径去使一个单一的细胞工厂用于快速生产，得到成本低廉的产品。 • 第四，建立一种生物技术系统来加以利用，此系统认为细胞作为一个整体（全细胞系统），而不是仅是一部分。

“氧化-还原”方面 • 氧化-还原反应 • 在工业中的实现应用氧化-还原转换已在整个细胞体现。 • [NAD+]+ H ↔ [NADH] • [NADP+] + H ↔ [NADPH]

微生物“氧化-还原”合成的工业产品 • Rhodococcus rhodochrous（丙烯酰胺-烟酰胺）, • Pseudomonas chlororaphis (5 -氰基-戊酰胺), • P. pseudocalcaligenes (D -扁桃酸), • Serratia marcenis (L -苏氨酸), • Erwinia herbicola (L -多巴-3,4 - 二羟基- L -苯丙氨酸), • Lactobacillus kefiri ((2R,5R)-己二醇), • Geotrichum candidum ((R) 和 (S)- 苯乙烯氧化物), • S. cerivisiae (麻黄素和伪麻黄素), • Nocardia coralline (环氧化的终端和近端的烯烃), • Candida rugosa ((R)-β-羟基异酸), • Alcaligenes sp. (手性环氧氯丙烷), • Leuconostoc mesenteroides ((R)-3-（ 4 -氟苯基）- 2 -羟基丙酸) • Hevea brasiliensis ((S)- 羟腈和 (S)-羟基羧酸) • …

木糖木糖醇 举例直接氧化磷酸脱氢酶(PTDH)

微生物混杂？（Microbial promiscuity） • 生物催化混杂或酶混杂应用的概念 • 这意味着酶可以催化不同的反应实现自然表现。 • 水解反应（水解酶）作为许多切实可行的混杂应用已被报告。

羟腈分裂酶 举例1 • 羟腈裂解酶（HNLs）在体内催化裂解羟腈的反应在植物中起防御作用。 • 然而，HNLs能够执行可逆反应，从而便利通过酶动力学控制，生产各种良好的手性羟腈产量和合理的高的对映体过量。。

举例2 • 此外，有人最近关于一个混杂的应用的报道： • 从平滑念珠菌还原酶反应得到的不对称亚胺。 • 该还原酶还能够减少C=O键的产生。近平滑念珠菌（全细胞）

创建一个微生物单细胞工厂 大背景： • 把单一酶转换野生型或工程菌宿主中产生酶，从而生成的目的产物。 • 这种做法也有其局限性，尤其是在试图建立一个新的化学组装生产线和利用廉价的原材料(如糖)，进行多种必需的反应来生产高价值的产品。 • 优化的一种选择是利用遗传装配在单一细胞，这一做法是建立微生物工厂或整个基因系统，能够生产任何种类的化学品。

最近的几个例子 • 抗疟疾药物——青蒿酸 • 类胡萝卜素 • 辅酶Q10 • 生产石油为基础原料的P -羟基苯乙烯可以由葡萄糖为原料，通过改造引进了其他生物的基因和代谢改造的工程菌大肠杆菌得到。

系统生物技术对菌种改良 • 菌种的改良目的有两点 • 第一，它能不能得到完全依赖于表达机制和提供原料所需所得到的基因产物。 • 第二，，基因的表达后表现出的效率高低，很多菌株重组后表达能力很低。 • 为了应付这种情况，一些系统的微生物的努力已经开始，其最终目标是获取和利用系统的知识了解基因的表达，细胞代谢，氧的传递，膜通透性和细胞稳定，已经有了一些成功例子以提高生产力的生物，并制定强有力的菌株可用于全细胞生物转换。

菌种： E.coli（大肠杆菌）, S.Cerevisiae（啤酒酵母）, Aspergillus terreus（土曲霉） A.niger （黑霉） Corynebacterium glutamicum （谷氨酸棒状杆菌）, Clostridum acetobutylicum（？）, 相关产品：蛋氨酸，多聚赖氨酸，胰岛素样的生长因子-1融合蛋白，多烷醇胺，人瘦素，核黄素， L -苏氨酸洛伐他汀（lovastatin）。【浓度高达数10g/L】相关菌种和产品

举例 • 改造后，工程菌可能产生的浓度超过10% (w/w) 难以表达的蛋白质，如：膜结合酶和辅酶依赖酶。但是这种生产水平可能会影响宿主代谢。 • 生产L -苏氨酸，利用大肠杆菌中反馈抑制的天冬氨酸激酶I和III（ thrA和lysC ），其转录衰减作用被隔开，通过采用转录相结合，在硅片上高通量反应分析检测氨酸降解途径。

“最小的基因组” • 基因和基因间有多余的DNA序列，在DNA的复制和表达中会“浪费”原料和能量。 • 人们设想把工程菌“多余的”基因或DNA序列去除，只保留一个“最小的基因组” ，这个最小基因组安全能满足工程菌的复制表达生物学功能。 • 40-60 ％的基因为基因组不知道，他们的缺失可能导致生物稳定性和代谢能力的下降，或降低菌株的环境抵抗性。

微生物环境基因组学的工业应用 大背景： • 众所周知的环境微生物，大多数是抗性培养，传统手段限制的微生物的应用。这种情况已促使发展了一种新的学科——环境基因组学。 • 现在已经有了一个策略去研究微生物基因组的特点和建立巨大的基因库的1033种假定环境基因

研究策略 • 首先，大规模的DNA测序批量捕获最大数量的可用的遗传资源，其进一步数据挖掘，主要是同源性为基础的，利用强大的计算机程序来计算。 • 测序项目寻找新的微生物群落的遗传信息和基因。（ http://www.genomesonline.org ） • 遗憾的是，新一代的庞大数据和大量的基因组测序的基因存入数据库，有高达40 ％的假设的或保守假设的蛋白质的相关数据没有得到很好的执行。

举例 • 证实了一种共居在牧场的土壤中分离得到的细菌，这种细菌能编码非霍奇金淋巴瘤内酯酶，重组大肠杆菌具有特殊的降解力： • 鱼腥草高丝氨酸内酯（ C6 - ，C7 -，C8 – 和C10 - HSL ） • 以及羟基取代或氧取代衍生物：OC6 - HSL ， OC8 HSL ，和OHC8 – HSL。

结论和未来 • 工业微生物学可能提供了更多的利用化学合成法是行不通的一个解决方案。 • 在这次文章中，不同的战略和例子说明和体现了工业发酵微生物和催化转换具有巨大潜力， • 包括新的微生物发现，酶的发现，微生物反应和代谢工程。 • 整体而言，所谓的‘宏观生物体’或‘微生物工厂’ ，可能会成为现实。 • 这将利用廉价的原材料和无数的合成基板（微生物）合成理想的产品。这还包括潜在的廉价和可持续的与化学工业所不能得到的高效的，个性化的，和功能化得材料。

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魏岱旭 2009-04-29