Bakteriális genom térképezés

1. Bakteriális genom térképezés Készítette: Mlinarics Edina IV. Biológus Bioinformatika SZIT

2. A genetika célja általában a genom szerkezetének, működésének és evolúciójának megértése A géntérkép fontos eszköz a genetikusok kezében

3. Munka eredményessége szorosan összefügg a rendelkezésre álló technikával • 1980-as évek közepéig a géntérképezés a rekombinációs kapcsoltságon alapult • A fő áttörést a fizikai térkép megalkotása jelentette • Az első, még hiányos térképet 1987-ben publikálták • 1995-ben közzétették az első teljes genom szekvenciát • Mostanra 16 baktérium és más organizmus genom szekvenciáját jelentették meg • Közel 50 folyamatban van

4. Bakteriális kromoszóma in vivo genetikai térképezése • Rekombinációs adatokon alapszik • A vizsgált markerek rekombinációs frekvenciája utal a gének fizikai távolságára. • A módszer fejlődésével egyre pontosabb térképeket készítettek (1992 Streptomyces coelicolor 130 lókusz)

5. Fizikai (makrorestrikciós) térképezés Az első fizikai kromoszóma térképet 1987-ben publikálták E.coli K12 • 50 kbp –nál nagyobb fragmenteknek agaróz gélen való futtatása nem lehetséges • 2 feltétel szükséges • Kevés hasító hellyel rendelkező enzimek a kromoszómán • Olyan eszközök amiket nagy fragmentumok vizsgálatára használnak

6. Ritkán-vágó hely-specifikus endonukleáz Fizikai térképezésnél fontos ,hogy a fragmentumokat el lehessen rendezni Random törések megelőzése, melyek az extrakciós eljárásnál deformáció során keletkeznek • Csapdába ejtik a sejteket • A sejtek lízise az agarózon belül történik • Kis molekulák eldiffundálnak a DNS bent marad • Az endonukleáz behatol az agarózhálóba és szétvágja a DNS-t • A kapott fragmentumokat elektoforézissel szétválasztják

7. Különböző tipusú enzimeknek csak korlátozott számú hasítóhelye van a kromoszómán Kb. 8 restrikciós enzim tartozik a II. tipusú ritkán vágó enzimek közé A NotI-t, ami 8bp szekvenciát ismer fel széles körben használják

8. Pulsed Field Gel Elecrophoresis (PFGE) 1982-1984 Schwartz és Cantor által tervezett eljárás • Nagyon nagy DNS darabok (35-2000kbp) • 2 elektródpárt alkalmaznak a gél körül, felváltva működtetik • A hosszú DNS szakaszok hossztengellyel megegyező térerő irányába vándorolnak • Minél hosszabb a DNS, annál lassabb a reorientáció • Tehát a hosszabb DNS darabok lassabban, míg a rövidebbek gyorsabban vándorolnak

9. Hátrányok: • A térképezést gátolhatja, ha túl sok fragment keletkezik az emésztés során • Ha a fragmentek túl kicsik, lemosódnak a gélről, mielőtt meg lehetne őket vizsgálni

10. Makrorestrikciós térképek készítése Számos módszert használnak a fragmentek sorba állítására (a kromoszómának megfelelően) • A fragmenteket amiket az első endonukleázos hasítás után kinyertünk újra emésztjük egy másik enzimmel Ezt elvégezzük fordítva is( először emésztünk a második enzimmel,majd másodjára az elsővel) Ez a módszer akkor pontos, ha a másodlagos emésztés után a fragmentek száma nem haladja meg a 20-25

11. Még pontosabb genomikai elhelyezkedést eredményez • a nagy számú fragmenteknél • a szomszédos kapcsolt fragmenteknél Az összekapcsoló klón az a klón, ami tartalmazza egy ritkán vágó enzim felismerési helyét és átfed 2 szomszédos makrorestrikciós fragmentummal A szomszédos fragmenteket kontigoknak nevezik, utalva az egymást érintő pozíciójukra a kromoszómán A klónokat meg lehet jelölni marker beillesztésével • A Listeria monocytogenes kromoszómájának a NotI helyét Kmr kazettával jelölték

12. Ez a kazetta DNS szekvencia, ami transzpozonból származik és antibiotikum rezisztenciát hordoz (ebben az esetben kanamicyn-t) Az ismert ORF-t hasonlóképpen lehet markerként használni Willems és mts 1998-ban sorba állították a Coxella burnetii genomjának 58 db NotI/Sau3 fragmentjeit

13. Smith és Birnstiel 1976-ban kidolgozott egy módszert, amit 1998-ban A Pseudomonas aeruginosa térképezésére használtak A fragmentumokat, amiket részlegesen emésztettek sűrűn emésztő enzimekkel, PFGE-vel szeparálták azután hibridizálták a próbák végeit olyan fragmentumokkal amelyeket ugyanabból a genomból csináltak ritkán hasító enzimek felhasználásával Egydüli sűrűn hasító enzimmel készült fragmentun hibridizálása 2 próbával azonosítja a ritkán hasító enzimmel kialakított kontigot Ismétlődő szekvenciák v. mobilis elemek kópiái téves sorba állítást eredményezhetnek

14. A rendezett klón DNS könyvtár v. enciklopédia Tartalmazza a DNS fragmentumok könyvtárát vektorba klónozva, a kromoszómán való átfedési sorrendnek megfelelően Az elsőt 1987-ben hozták létre

15. A vektor kiválasztása a rendezett klón könyvtár A lambda-alapú vektorok 10-25 kbp Kozmid 5-50 kbp PI-alapú vektorok 90 kbp YACs 75-2000 kbp BACs 20-100 kbp A BACs-ban (E.coli ) F-plazmid replikációs eredetű, ezek stabilabbak és széles körben használják az eukarióta gén könyvtárhoz

16. AZ E.Coli K12 Kromoszóma térképe A genetikai kapcsoltsági térkép 99 gént mutatott(1964) később 166 –t (1967) ez egy hagyományos géntérképezési eljáráson alapult ami konjugáció utáni rekombinációt vagy PI fággal való transzdukciót használt Ez a megközelítés bizonyította először a bakteriális genom cirkularizáltságát Egyre teljesebb géntérkép, ahol 1500 gén pozíciója ismert, ami a teljes kromoszóma 20-25%

17. A Bakteriális genom első fizikai térképének publikálása új távlatokat nyitott a molekuláris biológia egyik irányzatában a genomikában ( a genom strukturák vizsgálatában) KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!