Formulación del Problema

1. EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE TRES CONSORCIOS DE CIANOBACTERIAS EN EL CRECIMIENTO Y VALOR NUTRICIONAL DE PASTO RYEGRASS ANUAL (Loliummultiflorum) A NIVEL DE CÁMARA DE INVERNADERO

2. Formulación del Problema • Salud humana • *Agua contaminada con nitratos • * La transformación de nitratos a nitritos desemboca en compuestos cancerígenos conocidas como Nitrosaminas(Suquilanda, 2003). • Fertilizantes Químicos • Uso de fertilizantes de forma desmesurada • Perjuicios al suelo, la atmósfera y agua de consumo • Ambiental • Contaminación de acuíferos subterráneos por lixiviación • Desbalance del ecosistema e infertilidad de suelos (Blanco, 1999). • Reducción de la diversidad microbiana y nutrientes naturales del suelo (Sanchez & Mass, 2009)

3. Producción Agraria • Empleo de microorganismos fotosintéticos con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico Justificación del problema

4. Objetivo general • Evaluar el potencial biofertilizante de tres consorcios de cianobacterias en el crecimiento y valor nutricional de pasto Ryegrassannual (Loliummultiflorum) a nivel de cámara de invernadero. Objetivos de la Investigación

5. Objetivos específicos • Obtener consorcios de cianobacterias a partir de diferentes muestras de suelo, biofilms y cortezas de árboles tomadas en las faldas del volcán Pasochoa. • Producir biomasa en medio líquido a partir de consorcios de cianobacterias mantenidos en medio sólido. • Preparar los biofertilizantes que serán empleados como tratamientos. • Evaluar bajo biofertilización la evolución del crecimiento del Raygrass en masetas. • Determinar la materia seca, humedad, proteína, fibra bruta, grasa y ceniza del Raygrass anual. • Comprobar la sobreviviencia de cianobacterias en el Raygrass anual.

6. Hipótesis de la Investigación • Hipótesis nula • Los tres consorcios microbianos con cianobacterias presentan similares efectos fertilizantes en el Raygrass. • Los consorcios microbianos con cianobacterias, como los fertilizantes orgánicos tienen el mismo efecto sobre las plántulas de Raygrass en crecimiento y valor nutricional. • Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias tienen el mismo efecto que un fertilizante químico • Hipótesis alternativa • Los tres consorcios de cianobacterias presentan diferentes efectos sobre las plántulas de Raygrass. • Los consorcios de cianobacterias y los fertilizantes orgánicos muestran diferentes efectos en el crecimiento y valor nutricional del Raygrass. • Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias, no presentan el mismo efecto que los fertilizantes químicos.

7. Biofertilizantes • Producto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicos • Su aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo. • Favorece la aireación y oxigenación del suelo • Son fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998). • Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos • Cianobacterias • Procariotas fotosintéticos, su tamaño varía de 0,5 a 70um de diámetro, carece de núcleo y organelos • Aislado de muestras ambientales, clínicas , animales y plantas. • Amplia distribución desde climas fríos, tropicales hasta los más extremos • En el área agrícola han sido empleadas como biofertilizante en forma libre y simbiosis • Tienen la capacidad de llevar a cabo la diferenciación celular • Generan celular especializadas (Heterocistos) donde se produce la fijación de nitrógeno mediada por la enzima nitrogenasa (luden, 2000).

8. Fijación biológica de Nitrógeno por cianobacterias • Producto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicos • Su aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo. • Favorece la aireación y oxigenación del suelo • Son fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998). • Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos

9. Recolección de muestras Lupinus spp. Metodología

10. % Humedad, Temperatura, Ph y Análisis Físico- Químico del Suelo Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas Decantación 90 ml y 95 ml Caldo Peptona 16 S 956 pb PAGS-F PAGS-R CVP (Diluciones seriadas en caldo peptona) (+) ETA 396 pb ETA 1 ETA 2 10-1 10-4 0,1 ml (Spilker et al, 2004) (Ashraf y Carl, 1994) Identificación Fenotípica de posibles cepas Pseudomonas aeruginosa Siembra Agar Cetrimida Secuenciación amplicón 16SPseudomona aeruginosay ETA Cultivo Puros Conteo UFC/g

11. Secuenciación amplicón 16S Pseudomonas aeruginosay ETA 1.- % Humedad, Temperatura (superficial, media y baja) y pH Identificación Fenotípica Identificación Genotípica DO260/DO280= 1,5 – 2 ng/uL= 5 Conteo UFC/g.s MUESTREO MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PROCESAMIENTO DE MUESTRAS IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Tinción GRAM (-) 2.- Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas Extracción de ADN 90 ml y 95 ml Caldo Peptona ETA 396 pb ETA 1 ETA 2 Oxidasa (+) PCR 16s Pseudomonas aeruginosa 16 S 956 pb PAGS-F PAGS-R CVP (Diluciones seriadas en caldo peptona) Cultivo Puros Identificación de pigmentos IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA (+) P. aeruginosa Pseudomonas spp. Decantación 10-1 10-4 3.- Análisis Físico –Químico muestra compuesta por campo (500g) : 6 submuestras Control - 0,1 ml IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA 1 King A King B 2 (Spilker et al, 2004) 1 (Ashraf y Carl, 1994) Pruebas Bioquímicas Siembra Agar Cetrimida No fermentadores TSI SECUENCIACIÓN Secuencia consenso O-F Medio Hugh Leifson Gelatinasa Acetamida Reducción de Nitratos Crecimiento a 4°C y 42°C.

12. 1.- Análisis Físico- Químico: FACTOR MICROBIOLÓGICO Resultados y Discusión • Figura 1 -2 . Densidad bacteriana de Pseudomonas spp (UFC/g.s) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

13. Tabla 2 Descripción de los lugares, campos, coordenadas geográficas e historia agrícola de los cultivos. Figura 3 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en las muestras de rizosfera y hoja de los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo. Figura 4 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

14. FACTORES FÍSICOS • Figura 5. Factores Físicos: Clase Textural, Humedad(%) y Temperatura (°C) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

15. FACTORES QUÍMICOS 1.-pH 2.- % Materia orgánica • Figura 6 Factores Químicos: pH y Materia Orgánica (MO %) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

16. FACTORES QUÍMICOS • Figura 7 Elementos inorgánicos B, Na, Ca, Mn y Zn en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

17. Tabla 3 Características fenotípicas de posibles cepas de Pseudomonas aeruginosa encontradas en los campos muestreados. 2.- Caracterización fenotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa

18. 3.- Caracterización genotípicamente los posibles aislados dePseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA • Tabla 4 Aislados positivos a la amplificación del gen 16S y ETA mediante el ensayo de PCR.

19. Tabla 5. Frecuencia de Pseudomonas aeruginosa en campos cultivados y silvestres en Lupinus spp. Prueba de contraste de independencia de variables cualitativas Chi – cuadrado X2.

20. 4.- Caracterización molecular de los amplicones los posibles aislados dePseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA Tabla 6 Resultados de secuenciación del amplicón 16s DNAr y amplicón ETA

21. Conclusiones • Los suelos rizósfericos de Lupinus spp, presentaron características texturales de suelos arenosos; valores bajos de temperatura a excepción de la comunidad de Musuk Pacarí y bajos porcentajes de humedad. • Entre los factores químicos de los suelos rizósfericos estudiados, el pH dio valores neutros, característica asociada a los suelos arenosos. • La variación de las cantidades de micronutrientes, Ca, Mn Na Zn y B está relacionado a los bajos valores de materia orgánica y baja capacidad de intercambio catiónico. • La densidad bacteriana de Pseudomonas spp 103-5 UFC/g.s de los suelos Lupinus spp fue menor en comparación con otros estudios que reportan valores de 10 6-7 . • La densidad bacteriana de Pseudomonas spp, fue significativamente diferente de acuerdo al tipo de muestras, existiendo una mayor cantidad en la rizosfera de las dos provincias.

22.  La caracterización fenotípica permitió identificar siete posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa, sin embargo estos resultados presentaron ambigüedad en las pruebas de crecimiento a 42°C y utilización de acetamida. • La caracterización molecular del los aislados que amplificaron el gen 16s DNAr de Pseudomonas aeruginosa y Exotoxina a través de PCR y secuenciación dieron como resultados tres aislados de P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR y 6 que poseen el fragmento de 396pb del gen ETA: 4 P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR, 42 y 2 P. fluorencens 11 y 19. • La cantidad de aislamientos de Pseudomonas aeruginosa depende del tipo de campo encontrándose con mayor frecuencia en campos cultivados que silvestres, las zonas de donde se aisló P. aeruginosa corresponden a las comunidades de Cachapamba San José y Chaloapamba caracterizados por ser un terreno de pastoreo y uso de abono orgánico gallinaza con rotación de cultivos de papa y zanahoria respectivamente. • La presencia de Pseudomonas aeruginosa en los campos cultivados permitieron advertir que la rizosfera es un potencial reservorio de este microorganismo. • La presencia del gen ETA en los aislados de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens presumió la trasferencia de genes de virulencia entre microorganismo habitantes de un mismo nicho ecológico.

23. Recomendaciones • Relacionar factores bioquímicos como respiración microbiana recuento de poblaciones microbianas, coeficiente metabólico e índices de mineralización para entender los cambios de parámetros microbiológicos calidad y salud del suelo. • cultivo de enriquecimiento como el caldo Acetamida que permita una selección previa de Pseudomonas aeruginosa. • Observar los pigmentos después del tiempo de incubación a 37°C se coloque las cajas a temperatura ambiente durante 24 horas para una mejor visualizan de los pigmentos. • Estudiar nuevas zonas geográficas donde se utilice sistemas de riego, abonos orgánicos.

24. A nivel molecular, realizar una identificación de otros factores de virulencia en Pseudomonas aeruginosa como Exoenzima S presentes en aislados ambientales y clínicos. • Utilizar otro tipos de genes como marcadores taxonómicos en la identificación de P. aeruginosa. gyrB, exoA, y algD; y primers específicos diseñados para la amplificación y secuenciación (Osayande, et al., 2009) que podrían ser utilizados en futuros proyectos. • Ensayos in vitro mediante la inoculación de cepas de Pseudomonas aeruginosa provenientes de muestras ambientales y clínicas donde hayan sido identificados factores de virulencia, para determinar y comparar el grado de virulencia de las diferentes P. aeruginosa y la respuesta del huésped. • Se recomienda el control de la carga microbial en sistemas de riego y abonos de animales de granja así como un análisis microbiológico de los indicadores de calidad de agua y abonos orgánicos.