1 / 84

Bioinformatika - Proteomika

Bioinformatika - Proteomika. Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport, SzBK e-mail: folkl @ cgl.ucsf.edu. Bioinformatika úgy általában. adatbázisok felépítése

darva
Download Presentation

Bioinformatika - Proteomika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Bioinformatika - Proteomika Medzihradszky (Fölkl) Katalin Dept. of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco és Proteomikai Kutatócsoport, SzBK e-mail: folkl@cgl.ucsf.edu

  2. Bioinformatika úgy általában • adatbázisok felépítése • ezen adathalmazok statisztikai analízise, matematikai értelmezése • szabályszerűségek meghatározása • szabályok hasznosítása – predikciók pl. funkcióra, rokonságra, eredetre, szerkezetre stb.

  3. Bioinformatika úgy általában • „összehordott” adatokból építkezünk • többnyire elmélet eleinte • a gyakorlati hasznosítás majd a végén jön • persze ez visszahat az elméletre

  4. Mit lehet kiaknázni? • genomiális adatbázisok • fehérje szekvencia adatbázisok • fehérje 3D szerkezeti adatbázisok • stb, stb Meghatározó faktor: Mennyire megbízhatóak az adatok?

  5. Proteomika A sejt fehérjetartalmának kvalitatív és kvantitatív jellemzése Mi van jelen? Mennyi? Milyen formában? Lokalizáció? Kölcsönhatások? Partnerek?

  6. Problémák • állandó dinamikus változások • hatalmas mennyiségi különbségek • igen eltérő fizikai tulajdonságok – még ugyanarra a géntermékre is

  7. Még mindig „problémák” Poszt-transzlációs módosítások Idő-, faj-, állapot-, lokalizáció- stb. -függő • permanens vs. dinamikus • teljes vs. részleges • jelentős vs. csekély méretváltozás • hidrofil • hidrofób Nem árt érteni a biológiához!

  8. Láthatóvá tenni a komplexitást... Frakcionálni kell ! 1D-, 2D-, multidimenziós módszerek

  9. 1D-SDS-PAGE * Minden belemegy a gélbe, de kicsi a felbontás. * Várhatóan fehérje-elegyeket kell analizálni

  10. 2D elfo 1. dimenzió: izoelektromos fókuszálás → pI szerint - pH 3-10 DE savas vagy bázikus fehérjék NEMfókuszálódnak membrán-fehérjék kicsapódnak – ionos detergens nem használható 2. dimenzió: SDS-PAGE

  11. 1. spot 7. spot 8. spot 5. spot 2. spot 9. spot 3. spot 6. spot 4. spot pH: 3 4 5 6 7 8 9 10 2 proteins 2 proteins 3 proteins 3 proteins 2 proteins 1 protein 1 protein 1 protein 4 proteins

  12. 2D elfo másképpen 1. dimenzió: 16 BAC-PAGE (pozitív „fejű” detergens) 2. dimenzió: SDS-PAGE Minden belemegy a gélbe, de átlósan frakcionálódik – kis felbontás

  13. Speciális 2D elválasztás 16-BAC S D S Pros35 10/14 (71%) 33% Pros7 34/36 (94%) 63% Pros6 12/12 (100%) 42% Pros28.1 14/21 (66%) 54% Pros29 19/23 (83%) 59% Pros2 13/15 (86%) 42% GC12000 13/14 (93%) 35% ProsMA5 22/44 (50%) 56% Pros25 12/15 (80%) 50% Pros3 18/24 (75%) 53% Pros26 6/15 (40%) 46% Pros5 11/12 (92%) 26% GC17331 11/23 (47%) 46% l(2)05070 15/19 (79%) 72%

  14. Festés • Commassie Brillian Blue – kvanti • Ezüst – érzékenyebb, de NEM kvanti Trükkök: • funkciós csoportra specifikus festés • differenciál festés

  15. 2D-kromatográfia 1. dimenzió: kation - ioncsere 2. dimenzió: fordított fázisú HPLC Követés: 215 nm-en → peptidkötés Nyilván semmi hidrofób nem érvényesül ilyen körülmények között... Reprodukálhatóság degradálódik az oszlop életkorával!

  16. Ki is kell találni mit is válogattunk szét! • Edman szekvenálás → N-terminuson blokkolt fehérjékkel, keverékkel nem megy • Western-blot → tudni kell, hogy mit keresünk, és kell jó ellenanyag

  17. alapötlet • Egy bizonyos fehérje adott specificitású enzimmel emésztve szekvenciájára jellemző hasítási termékeket fog produkálni • Ha a valóságos emésztményt az adatbázis „in-silico” eredményeivel összevetjük azonosítani tudjuk a fehérjét Az összehasonlítás alapja csak valami biztosan megjósolható és egyértelműen meghatároztató tulajdonság lehet: TÖMEG

  18. A tömegspektrometria előnyei • alkalmazható keverékekre • blokkolt fehérjékre is • kovalens módosítások azonosíthatóak

  19. Detektálási érzékenység • Edman szekvenálás – kb. 1 pmól - 10-12 M • MS – kb. 5-50 fmól - 5x 10-15 - 10-14 M • Western blot –kevesebb, mint 10-15 M

  20. MS-alapú Proteomika • Fordított bioinformatika: mérési adatok + adatbázisok + algoritmusok →biológiai eredmények Tudni illik valamit az analitikai módszerről

  21. Mass Spectrometry 101 • Ionokat mérünk Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Electrospray Ionization – többszörösen töltött ionok • Nagy vákuumban • quadrupole, Time-of-Flight, ioncsapda MS →MH+ adatok MS-MS alias CID, CAD, PSD ... → szekvencia info

  22. Monoizotópos tömeg csakC12, H1, N14, O16 and S32 ← 1C13 2 C13

  23. Felbontás: m/Dm = 1567.69/0.2 ~ 8000

  24. Miért is kell felbontás?

  25. Normál peptid, 1000-es felbontás

  26. Normál peptid, 10 000-es felbontás

  27. Br-Trp-tartalmú peptid, 1000-es felbontás

  28. Br-Trp-tartalmú peptid, 10 000-es felbontás

  29. 3+ töltésű peptid, kis felbontás

  30. 3+ töltésű peptid, nagy felbontás 492.26522 Δ = 0.33426 = kb. 1/3 492.59948

  31. Tömegmérés pontossága 0.1 Da mérési hiba egész jó 2 kDa-nál, DE katasztrófális egy kis molekulánál Relatív értéket adjunk meg! pars per million

  32. Milyen pontosan tudunk mérni? belső standarddal 20 ppm-en belül ± 0.02 Da @ 1000 külső standarddal 200 ppm-en belül ± 0.2 Da @ 1000 intakt fehérjékre 0.1%-on belül ± 100 Da @ 10 000 Gyenge jeleknél nem érvényesül a Gauss eloszlás!

  33. Emésztési elegy MALDI-spektruma

  34. Peptidek ESIMS analízise

  35. Intakt fehérjék MALDI-analízise

  36. Intakt fehérje ESI-analízise

  37. Ha ez így megy, minek egyáltalán emésztgetni? Miért nem mérjük az intakt fehérjéket? preparatív és interpretív akadályok

  38. Minta-előkészítés Legyen a fehérje hozzáférhető a hasításra: → denaturálás → diszulfid-hidak bontása Emésztés, kémiai hasítás

  39. Specifikus hasítások • tripszin - Lys↓ Arg ↓ • endoproteáz Lys-C - Lys ↓ • endoproteáz Glu-C - Glu ↓ (Asp ↓) • endoproteáz Asp-N - ↓Asp (↓Glu) pH kb. 7.5 - 8 • CNBr (+75 %-os TFA) - Met ↓

  40. Az analízis • Egybemérjünk vagy frakcionáljunk? MALDI vs ESIMS LC-MALDI LC-ESIMS

  41. Mennyire kellene pontosan mérni a peptideket ? MH+ = 1296.4 ± 0.3 ppm • 9 különböző aminosav-összetétel • 36292 különböző szekvencia • 3 különböző elemi összetétel Ile/Leu ThrVal/SerLeu GlyGlu/AlaAsp

  42. Miért kell még szekvencia info? • Keverékek • Kovalens módosítások • Izoformák • Splice variants • És ha nincs bent az adatbázisban?

  43. Hogyan tegyünk szert a szükséges információra? Feladat: → meghatározni a komponensek tömegét → egyet fizikailag elkülöníteni → „szétverni” Műszeres megoldás: tandem tömegspektrometria, ionkapu, ioncsapda Fragmentálás: post-source decay (PSD), ütközéses aktiválás (CID/CAD), elektron-befogás (ECD)

  44. Peptid fragmentáció NH2-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-CO~ ~CO-NH-CH(Rn)-COOH yn-2 bn-1 yn-1 y1 b2 bi=S gyöksúly + 1 (72) 159 256 371 534 Ala-Ser-Pro-Asp-Tyr-Arg 637 550 453 338 175 yi = S gyöksúly + 19 A fragmentáció módszer- és készülék-függő!

  45. 60.04 S 130.09 y1-NH3 276.16 y2 399.21 b3+H2O 528.25 b4+H2O 70.07 R 138.07 H 277.14 HR-NH3 406.18 HRE-NH3 552.29 y4-NH3 84.08 K 147.11 y1 286.15 RE 415.23 y3-NH3 556.26 m3 87.09 R 197.10 a2 294.17 HR 423.21 HRE 569.32 y4 100.09 R 207.09 b2-H2O 336.18 a3-NH3 432.26 y3 575.30 m2 101.11 K 225.10 b2 353.20 a3 465.22 a4-NH3 583.32 m4 102.06 E 258.16 RE-28 363.19 b3-H2O 482.25 a4 584.27 m5 110.07 H 259.13 y2-NH3 364.17 b3-NH3 492.23 b4-H2O 625.33 m1 112.09 R 266.17 HR-28 381.20 b3 493.22 b4-NH3 129.10 K 269.12 RE-NH3 395.22 HRE-28 510.24 b4 SHREK - Elméleti MALDI-CID spektrum – MS product

  46. 131.0946 z1 242.1253 c2 353.2050 a3 416.2383 z3 527.2690 c4 197.1039 a2 260.1372 z2 398.2264 c3 482.2476 a4 553.2972 z4 SHREK – elméleti ECD fragmensek Elméleti „spektrum”: → lehetséges fragmensek, egyenlő intenzitással

More Related