1 / 68

Bioinformatika gyakorlat (biomérnök hallgatóknak)

Adatbázisok Szekvencia illesztés Hasonlóság keresés Filogenetikai programok PCR primer tervezés Promóter predikció (génpredikció). Bioinformatika gyakorlat (biomérnök hallgatóknak). Kiindulási „anyag” a szekvencia.

sezja
Download Presentation

Bioinformatika gyakorlat (biomérnök hallgatóknak)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Adatbázisok Szekvencia illesztés Hasonlóság keresés Filogenetikai programok PCR primer tervezés Promóter predikció (génpredikció) Bioinformatika gyakorlat(biomérnök hallgatóknak)

  2. Kiindulási „anyag” a szekvencia • Molekuláris biológiában, taxonómiában/filogenetikában használt „objektum” a szekvencia • DNS nukleotidsorrend • Fehérje aminosav-sorrend • Milyen információt hordoz • Gén/géntermék • A szekvencia „hasonlóságban” rejlő információ • Leszármazás/eredet/változás • Funkcionális • Szerkezeti

  3. Egyéni (csoportos) feladat beadása elektronikus formában

  4. Szekvencia manipuláció • Adatbázisok • Szekvencia letöltés/manipuláció • Hasonlóság kimutatása – számítógép szerepe > sm16-3 1 nt sequence GGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGACGAACCATGGCCAAGCGAAAGGCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATGGCGAAGGCAACCCCCGAGATTGAGCCGCCGGCAAACGTGCCGCTCGACGAAGAAGACCTGCCGTTCTTCCGCAACGTGATCGCTGAGTACGCGCGGTCGGAATGGTCGTCGCATCAACTCGAGCTCGCCGCAATGCTGGCCCGCACCATGGCGGACCTGACGCGCGAGCAGAAACTGCTGCGAGACGAAGGCGGTGTTGCCTACTCCGAAAAAGGCACACCTGTCGCGAATCCGCGCAAGTCGATTGTGCAAATGCACGCCAGTTCGATCCTGTCCTTTCGTCGATCATTGTCGCTTCACGCACGCGCGCAAGCGGGCGAGGCGAGGGACGTTGCGAAGCGCC > sm16-3 2 nt sequence GGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGACGAACCATGGCCAAGCGAAAGGCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATGGCGAAGGCAACCCCCGAGATTGAGCCGCCGGCAAACGTGCCGCTCGACGAAGAAGACCTGCCGTTCTTCCGCAACGTGATCGCTGAGTACGCGCGGTCGGAATGGTCGTCGCATCAACTCGAGCTCGCCGCAATGCTGGCCCGCACCATGGCGGACCTGACGCGCGAGCAGAAACTGCTGCGAGACGAAGGCGGTGTTGCCTACTCCGAAAAAGGCACACCTGTCGCGAATCCGCGCAAGTCGATTGTGCAAATGCACGCCAGTTCGATCCTGTCCTTTCGTCGATCATTGTCGCTTCACGCACGCGCGCAAGCGGGCGAGGCGAGGGACGTTGCGAAGCGCC

  5. > sm16-3 1 nt sequence • CGAACCATGGCCAAGCGAAAGGCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATGGCGAAGGCAACCCCCGAGATTGAGCCGCCGGCAAACGTGCCGCTCGACGAAGAAGACCTGCCGTTCTTCCGCAACGTGATCGCTGAGTACGCGCGGTCGGAATGGTCGTCGCATCAACTCGAGCTCGCCGCAATGCTGGCCCGCACCATGGCGGACCTGACGCGCGAGCAGAAACTGCTGCGAGACGAAGGCGGTGTTGCCTACTCCGAAAAAGGCACACCTGTCGCGAATCCGCGCAAGTCGATTGTGCAAATGCACGCCAGTTCGATCCTGTCCTTTCGTCGATCATTGTCGCTTCACGCACGCGCGCAAGCGGGCGAGGCGAGGGACGTTGCGAAGCGCC • > sm16-3 2 nt sequence • GGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGACGAACCATGGCCAAGCGAAAGGCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATGGCGAAGGCAACCCCCGAGATTGAGCCGCCGGCAAACGTGCCGCTCGACGAAGAAGACCTGCCGTTCTTCCGCAACGTGATCGCTGAGTACGCGCGGTCGGAATGGTCGTCGCATCAACTCGAGCTCGCCGCAATGCTGGCCCGCACCATGGCGGACCTGACGCGCGAGCAGAAACTGCTGCGAGACGAAGGCGGTGTTGCCTACTCCGAAAAAGGCACACCTGTCGCGAATCCGCGCAAGTCGATTGTGCAAATGCACGCCAGTTCGATCCTGTCCTTTCGTCGATCATTGTCGCTTCACGCACGCGCGCAAGCGGGCGAGGCGAGGGACGTTGCGAAGCGCCGGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGA

  6. Illesztett szekvencia --------------------------------------- • CGAACCATGGCCAAGCGAAAG • ||||||||||||||||||||| • GGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGACGAACCATGGCCAAGCGAAAG • GCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATG • |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||.... • GCGCGCATCGACAGCGCCGCCGAAGCCGTGCGCGTCATG • GGGACGTTGCGAAGCGCC--------------------------------------- • ....|||||||||||||||||| • GGGACGTTGCGAAGCGCCGGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGCGAGCGATAGTGCTAACTCAAAAAATCCTATGAGGA

  7. Adatbázisok • NCBI, EBI, GenomeNet • PubMed • Elsődleges (nukleotid) • Származtatott (aminosav szekvencia, egyéb jellemzők

  8. Illesztési módszerek a hasonlóság függvényében • A skála az illesztett fehérjeszekvenciák közötti százalékos egyezést mutatja • Két véletlen szekvencia illesztése ~20 %egyezést mutat • 20 % alatt nem szignifikáns az illesztés

  9. Homológia és hasonlóság • A homológia fogalmát gyakran hibásan használják • Két szekvencia homológ, ha közös őstől származik • Az analóg szekvenciák olyan nem homológ szekvenciák, amelyekben hasonló szerkezetű részek vagy hasonló funkcionális helyek találhatók, és ezek konvergens evolúcióval jöttek létre • A homológia nem a hasonlóság mértéke • Az olyan kifejezések, mint „a szekvenciák 50 %-banhomológok” vagy „a szekvenciák nagyfokú homológiát mutatnak”, értelmetlenek • A hasonlóság egy tény, a homológia egy hipotézis ill. következtetés • A hasonlóság kvantitatív, a homológia kvalitatív

  10. Alapfogalmak • Szekvencia illesztés ->Homológia-vizsgálat kimutathatja: • Leszármazási viszonyokat • Szerkezetet illetve funkciót mutathat • Szekvencia hasonlóság, szerkezeti és ezáltal funkcionális hasonlóságot mutat

  11. Szignifikancia • A matematikai és a biológiai szignifikancia különbözik • Pl. kis komplexitású régiók, konvergens evolúcióval létrejött hasonlóság • Ebből fakadó korlátok • Az adatbázis-kereső algoritmusokban • A szekvenciaillesztőalgoritmusokban • A mintázat-felismerési módszerekben • A funkcionális hely-és szerkezetpredikciós eszközökben • Ezért mindig ajánlatos a szekvenciaelemző módszerek széles körét alkalmazni • Egyik módszer sem tévedhetetlen!

  12. Szekvencia illesztés során az evolúciós változások figyelembe vehetők • Pl. ha van 2 rokon fehérje, ugyanaz a funkciója • Ha egymáshoz illesztjük a szekvenciát sok eltérés lehet • Ettől még hasonló • A helyettesítési mátrixok ezt veszik figyelembe

  13. Változások az evolúciósorán • Nukleotid sorrendben • Pontmutáció: tranzíció, transzverzió • Nukleotid szubsztitúció: pontmutáció SNP – single nucleotide polymorphism • Szegmentális mutáció: del, in, inv – ha nem egy nukleotidot érint • Szinonim ill. nem-szinonim szubsztitúció - vigyázat! – nem biztos, hogy a szinonim szubsztitúció kihatás nélküli – pl. splicing megváltoztatása • Nukleotidok nem-random előfordulása: a 4 bázist tartalmazó nukleotidok nem 1:1:1:1 arányban találhatók a genomokban; • Dinukleotidok nem-random előfordulása: funkcionális kényszerek a genetikai kód miatt

  14. Nukleotid sorrendben (folyt.) • Nem-random a szinonim kodonok használata: RSCU – relative synonymous codon usage • n = a szinonim kodonok száma egy aminosavra (1 – 6) • i = egy adott kodon • Xi= egy adott kodon előfordulási száma • ha azonos gyakorisággal használtak, akkor az RSCU-k összege 1 • Effektív kodonszám: ENC • 20 – 61: 20 – minden aminosavra egy kód • 61 – teljesen random, nincs kiemelt kód

  15. Helyettesítési modellek (nukleinsav) • Kodonhasználat: • nem teljesen univerzális a genetikai kód: mitochondriális genom, néhány prokarióta, egysejtű, ill. gomba spec. kodonokkal rendelkezik • hiányzó kodonok: néhány szervezetben a fehérjéket kódoló régiókban sosem fordulnak elő bizonyos kodonok • hozzá nem rendelt kodonok: a kodon megtalálható, de nincs hozzá tRNS a megfelelő antikodonnal – leáll a transzláció, a polipeptid a riboszómához kötötten marad • Azonossági (szubtitúciós) mátrix nukleotidokra • Pl: egyezés 1, mismatch 0 (vagy egyezés 5, eltérés -4) • Esetleg súlyozható • Tranzíció kisebb súllyal • Transzverzió nagyobb súllyal (előadás későbbi részében)

  16. Szekvencia változások az evolúciósorán • Aminosav/fehérje szinten • Aminosav kémiai tulajdonságait, hasonlóságait figyelembe vevő márix • A hasonló fiziko-kémiai tulajdonságokkal rendelkező aminosavak illeszkedését nagyobb súllyal veszi figyelembe (osztályozás alapja: poláros vagy apoláros, méret, alak, töltés) • Észlelt helyettesítéseken alapuló szubsztitúciós mátrixok • Az illesztett szekvenciákban észlelt aminosav-helyettesítési gyakoriságokon alapulnak • Fehérjeszekvenciák illesztésénél ma már szinte csak ilyeneket használnak • Pl: PAM, BLOSUM

  17. Észlelt helyettesítéseken alapuló mátrix • Dayhoff mutációs mátrix • Közeli rokon szekvenciák illesztéséből (legalább 85% hasonlóság, 70 illesztés, 2450 helyettesítés megfigyeléséből) • PAM mátrix létrehozása (log odds mátrix) • PAM = Percent Accepted Mutation • 1 PAM az adottevolúciós időtartam alatt 1 aminosav kicserélődése elfogadott (accepted) 100 aminosav esetén (1%) • Feltételezés: a mutáció független az aminosavtól (hogy mi volt előtte) és a pozíciótól (hol helyezkedik el a szekvenciában) • A fenti alapján interpolálható az aminosavak változása PAM1xPAM1=PAM2 (kétszer olyan távoli esemény esetén az aminosav változás) • PAM250 (PAM1250) kb. 20% aminosav azonosságot jelent

  18. Helyettesítési mátrixok • BLOSUM mátrixok • BLOCKS adatbázisból származó adatokból • Távolabbi rokon szekevenciák hézag nélküli blokkjainak többszörös illesztése • BLOcks SUbtitution Matrix BLOSUM • Log odds mátrix

  19. BLOCKS adatbázis —> BLOSUM • Többszörös illesztés -> blokkok • Rokon szekvenciák hézag nélküli blokkjainak többszörös illesztése • Nincsenek hézagok, konzervált régiók -> megbízhatóbb illesztése • Klaszterezés páronkénti hasonlóság alapján • pl. minden szekvencia 80% hasonlóságot mutat minden másikkal • Ebből helyettesítési gyakoriságok számolása -> mátrix • Pl: BLOSUM80

  20. Hogyan készül a mátrix • Általános képlet (log odds) Sij pontérték mátrixelem (Score az adott mátrix elemre, negatív várható pontérték random szekvenciákra)λ=pozitív konstans qij észlelt aminosavpár gyakoriság az illesztésekben (célgyakoriság, ∑=1) pi és pj aminosav előfordulási gyakoriságok az adott aminosavra (háttérgyakoriságok)

  21. BLOSUM62 mátrix

  22. Páronkénti összehasonlítás • Pontábrázolás (dotplot)

  23. A dotplotok értelmezése

  24. Fehérje dotplot

  25. Fehérje dotplot

  26. Nukleinsav dotplot

  27. Illesztés pontozása • Helyettesítési mátrixból vett pontértékek • Pl: PAM 250 helyettesítési mátrix felhasználásával 1. szekv. M N A L S D R T 2. szekv. M S D R T T E T pont 6 1 0 -3 1 0 -1 3 = 7

  28. BLOSUM62 helyettesítési mátrix

  29. Páronkénti illesztések • Optimális illesztések: • Globális és lokális illesztés

  30. „Optimális” illesztések • Szekvencia-illesztés(„alignment”): két szekvencia olyan elrendezése, amely megmutatja, hogy a két szekvencia hol hasonlít, illetve hol különbözik egymástól • hipotézis: pozícionálishomológia • Optimális illesztés: a legtöbb egyezést és a legkevesebb különbséget mutató szekvenciaillesztés • Matematikailag optimális, azaz az alkalmazott pontozási rendszerrel a legnagyobb pontértéket mutató illesztés • Hogy egy adott esetben a nagyszámú lehetséges illesztés közül melyik lesz optimális, az nagymértékben függ az alkalmazott pontozási módszertől!

  31. Páronkénti illesztés: lokális vagy globális

  32. Hézagok pontozása (gap penalty) • Lehet fix, de általában a hézag hosszával növekszik • „Affin” hézagbüntetés (wx, két részből áll): • Hézagnyitási büntetés (nagy): g • Hézagkiterjesztési büntetés (kisebb): rx wx=g+rx ahol x a hézag hosszúsága • A pontozási mátrixtól függetlenül is módosíthatók, de a pontozási mátrix korlátozza, hogy milyen határok között • Az alapértelmezett értékek általában tapasztalati úton lettek beállítva, és tipikus feladatokra jól használhatók, pl. BLAST-nál

  33. Páronkénti illesztés algoritmusa

  34. Az illesztési mátrix kitöltése (Hij értékek)

  35. Az illesztések eredménye • Két alternatív globális illesztés sequence 1 M - N A L S D R T sequence 2 M G S D R T T E T Score 6 -12 1 0 -3 1 0 -1 3 = -5 sequence 1 M N - A L S D R T sequence 2 M G S D R T T E T Score 6 1 -12 0 -3 1 0 -1 3 = -5 • Globális illesztés, de nincs hézagbüntetés a végeken sequence 1 M N A L S D R T - - - Sequence 2 - - M G S D R T T E T Score 0 0 -1 -4 2 4 6 3 0 0 0 = 10

  36. Többszörös illesztés • Multiple sequence alignment (MSA vagy msa) • Kettőnél több szekvencia optimális illesztése • Célja hogy minél több egyező karaktert (nukleotid, vagy AA) egy oszlopba rendezzen • Tartalmazhat illeszkedést (match), nem illeszkedést (mismatch) és hézagokat (gap) (emiatt bonyolult probléma

  37. Többszörös illesztési megközelítések • Dinamikus programozás kiterjesztése • Progresszív globális illesztés • Iteratív módszer • Motívumokat felhasználó illesztés • Statisztikai módszerek probabilisztikus modellek felállításával

  38. A többszörös illesztésben lévő információ • Egy adott szekvencia készlet többszörös illesztése úgy tekinthető, mint a • Szekvenciák evolúciós töténete • Azok a szekvenciák, amelyek jól illeszkednek, valószínűleg később divergálódtak a közös ős szekvenciától • Olyan szekvencia csoport, amelyik rosszabbul illeszthető, komplexebb és távolibb evolúciós kapcsolatot mutat

  39. Az illesztés megvalósítása egyenértékű a szekvenciák közötti evolúciós kapcsolatok feltárásával

  40. Többszörös illesztés • Nehéz vagy bonyolult feladat? • Nagy hasonlóság esetén triviális • Inzerciók, deléciók esetén nem hogy nem triviális, hanem még számítógépekkel is bonyolult feladat

  41. Felhasználás • Szekvenálás (genom szekvenálás, shotgun szekvenálás) • Strukturális funkcionális részek azonosítása • Fehérjében, domén vagy katalitikus aminosav • Nukleotid szekvenciában pl: promóter fehérje kötő hely stb.

  42. Felhasználás • Új szekvenciák és meglévő családok közötti hasonlóság (és homológia) felderítése • Másodlagos és harmadlagos fehérje szerkezetek előrejelzésének segítése (pl. homológia modellezés) • Oligonukleotid primerek tervezése • Filogenetikai analízis alapfeltétele

  43. MSA és evolúciós fa kapcsolata • Optimális illesztés minimalizálja a fán a mutációs lépések számát

  44. MSA dinamikus programozási algoritmussal • Probléma • 2 szekvencia összehasonlításánál • Az összehasonlítások száma NxM, ahol N az egyik szekvencia hossza, míg M a másiké • Tegyük fel, hogy a két szekvencia egyforma hosszú, N=M, ekkor az összehasonlítások száma N2 • 10 szekvencia esetén az összehasonlítások száma N10 pl. 10db 300 AA hosszúságú fehérje esetén 30010=5,9x1024

  45. Scoring mátrix 3 szekvenciára A szekvencia A-B B szekvencia A-C MSA (A-B-C) B-C C szekvencia

  46. Egyszerűsítés

  47. Progresszív módszer • ClustalW (a leggyakrabban használt program) • 1. minden szekvencia páros összehasonlítása • 2. az illesztési pontértékek felhasználása filogenetikus fa készítéséhez (vezérfa) • 3. egymás utáni szekvencia illesztés a vezérfa alapján • Először a leghasonlóbb szekvenciák illesztése történik meg, majd ehhez illeszti az egyre kevésbé hasonlító szekvenciákat

  48. Clustal • Távolságmátrix a páros illesztésekből • Vezérfa szerkesztése • Illesztés a legnagyobb hasonlóságot mutató szekvenciák illesztésével

  49. Legfőbb probléma a progresszív illesztéssel, hogy a kezdeti illesztéstől nagymértékben függ a többszörös illesztés • Ha hasonló szekvenciákra nézzük, akkor jó eredmény • Az elején beillesztett gap pl. nem módosul az illesztés során vagy a korán elkövetett illesztési probléma kihat az egész illesztésre (lokális minimum probléma, az algoritmus „greedy” mohó természetéből fakad

More Related