1 / 38

Riza Rahmawati 0910710112

PENGARUH EKSTRAK METANOL DAUN KELOR ( Moringa oleifera ) TERHADAP EKSPRESI HSP25 PADA KARSINOGENESIS KOLON TIKUS WISTAR YANG DIINDUKSI 7,12-DIMETHYLBENZ[A]ANTHRANCENE (DMBA). Riza Rahmawati 0910710112. Latar Belakang.

dior
Download Presentation

Riza Rahmawati 0910710112

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PENGARUH EKSTRAK METANOL DAUN KELOR (Moringaoleifera) TERHADAP EKSPRESI HSP25 PADA KARSINOGENESIS KOLON TIKUS WISTAR YANG DIINDUKSI 7,12-DIMETHYLBENZ[A]ANTHRANCENE(DMBA) RizaRahmawati 0910710112

  2. LatarBelakang • Kankermenyumbang 13% total kematianduniadandi Indonesia terdapat 245 orangtiap100.000 pendudukmeninggalkarenakanker (WHO, 2008). • Tingkat kejadiankankerkolorektalsemakinmeningkatpadadaerah Asia danAfrika (GLOBOCAN, 2008). • Hal iniberkaitandenganperubahangayahidup (diet kurangserat, banyakmakandagingmerah, merokok) yang mulaidiadaptasiolehnegara Asia Afrika, faktorketurunandanpaparanzatberbahayalainnya (yang banyakdialamadalah PAH, salahsatuanggota PAH yaitu DMBA) yang dapatmemicumutasi gen.

  3. Mutasi gen tertentudapatmenyebabkanpeningkatanproliferasiselsecara abnormal dantidakresistenterhadapmekanisme apoptosis. • Salahsatucaraseluntukmenghindardarimekanisme apoptosis adalahdenganmengganggukeseimbanganantara protein proapoptosisdanantiapoptosis, menurunkanfungsicaspase, danmelemahkansinyalreseptor apoptosis (Wong, 2011). • Salahsatuagenantiapoptosisadalah HSP25. HSP25 dapatberikatandengan protein kunci apoptosis (misal: caspase 3) • HSP25 perludihambat

  4. Upayapengobatanterhadapkankertelahbanyakdilakukanmeliputipembedahan, kemoterapi, danradioterapi, tetapibelummemberikanhasilmaksimaldanmemilikibanyakkendala (misal: kurangselektifdanbiayatinggi). Upayapencegahanperludilakukan • Moringaoleiferatelahbanyakdigunakandalampengobatantradisional, memilikikandungangizi yang tinggi, antara lain flavonoid , dan yang terbanyakadalahquercetin (Coppin, 2008). • Flavonoiddapatbersifatsebagaiantoksidan • Quercetindapatmengurangisintesis HSP (LamsondanBrignall, 2000) Moringaoleiferakandidat yang baikdalammenghambatkarsinogenesis

  5. RumusanMasalah • Apakahekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) dapatmenurunkanekspresi HSP25 padajaringankolontikusWistar yang diinduksi DMBA? TujuanPenelitian • Mengetahuiefektifitasekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) terhadappenurunanekspresi HSP25 padajaringankolontikusWistar yang diinduksi DMBA.

  6. ManfaatPenelitian ManfaatAkademik • Menambahkankonseptentangperanekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) dalamproses apoptosis yang berhubungandengan HSP25 dalamkarsinogenesiskolon. ManfaatPraktis • Mengembangkanpotensiekstrakdaunkelor (Moringaoleifera) sebagaitanaman herbal untukpencegahankankerkolon. • Mengembangkanobat herbal untukpencegahankankersecaraluas yang efektif, efisien, danterjangkau.

  7. KankerKolon EtiologidanFaktorRisiko • Genetik • Inflamasikronis • Paparanterhadapbahaniritan • Alkohol • Diet rendahserat meningkatkanwaktu transit diusus memperlamakontakmukosaususdenganasamempedu • PAH (polycyclic aromatic hydrocarbon)

  8. Patogenesis Karsinogen Hiperplasia Displasia Carsinomain situ Malignan mutasi DNA mutasi DNA diteruskanpadaselanak selhiperplasia dapatregresijika stimuli dihentikan selsedikitterdiferensiasi, banyakpetumbuhansel abnormal munculpolip seltidakterdiferensiasi tidakinvansif (benign) invansif

  9. JenisKankerKolon • Adenokarsinoma95% dari total kankerkolon, berasaldarisel goblet • Gastrointestinal carcinoid tumor berasaldariselneuroendokrin • Primary colorectal lymphomas berasaldarisellimfosit • Gastrointestinal stromal tumors  berasaldariinterstitial cell of Cajalyaitusel yang berperandalamkontraksiototpolosdenganmengeluarkanslow wave potential • Leimyosarcomaberasaldariselototpoloskolon cancercenter.com

  10. DMBA • DMBA adalahsalahsatuanggota PAH yang bersifatkarsinogenik, mutagenik, danimunosupresor. • Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) berasaldarihasilpembakarantidaksempurnabahan-bahan yang mengandungkarbon (Winsconsin,2000)

  11. Metabolisme DMBA mutasi DNA epoksidahidrolase dihydrodioldehydrogenase anggotasitokrom P450 Denaturasi protein Kerusakan DNA ROS benzo[a]pyrene quinones Tsai-Turtonet al, 2007; Igawaet al, 2009

  12. HSP25/27 HSP25 padatikusadalah homolog HSP27 padamanusia • Fungsi • memfasilitasipelipatan protein (folding) • mencegahagregasi protein • memfasilitasire-folding protein yang terdenaturasiataumendegradasi protein yang tidakdapatdire-folding, • memodulasipenggabunganataupenguraiankompleks protein • mentransport protein melewatimembranseluler (Powers et al, 2009) • Sintesis • Multi-chaperon complex (HSF1+HSP40, 70, dan 90) HSF1 monomer  translokasikenukleus HSF1 trimer  HSE  transkripsi (mRNA)  translasi HSP

  13. HSP25/27 dan Apoptosis Aryaet al, 2007

  14. Moringaoleifera • Daunkelormengandung : • banyakkalsium, fosfor, selenium, asam amino tinggi yang sebandingdenganputihtelur, sertaalfa-linolenat. • 12 flavonoiddengan yang terbanyakadalahquercetinglikosida, kaemferolglikosida, danglikosidamalonat (Coppin, 2008). • Flavonoiddiketahuimemilikiefekantimutagenik, antikarsinogenik, antiinflamasi, antioksidan, antihepatotoksik, sertaantimikroba (Narayanaet al, 2001). • Quercetindapatmengurangiekspresi HSP dengan • menghambatikatanantara HSF dengan HSE pada DNA dengan • mengubahstruktur HSF danmenurunkanaktifasitranskripsi DNA melaluipenghambatanforforilasi HSF (Hosokawa, 1992)

  15. KerangkaKonsep

  16. HipotesisPenelitian • Ekstrakmetanoldaunkelordapatmenurunkanekspresi HSP25 padajaringankolontikusWistar yang diinduksioleh DMBA melaluikandunganflavonoidsebagaiantioksidandalammenurunkanproduksi ROS danterutamaquercetindalammenghambatsintesis HSP25.

  17. MetodePenelitian RancanganPenelitian • Penelitianinimerupakanpenelitianeksperimental • Rancanganeksperimental yang digunakanadalahrancanganeksperimensederhana (post test control group design) dimanasubyekdibagimenjadi 5 kelompoksecara random

  18. Hewan Coba • Hewan Coba, Objek dan Teknik Randomisasi • Tikus jenis Rattus norvegicus galur wistar jantan dewasa dengan umur + 2 bulan yang dipelihara di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. • Teknik randomisasi untuk pengelompokan perlakuan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Randomized Completely Design (RCD) mengingat baik hewan coba, bahan pakan, dan bahan penelitian lainnya dapat dikatakan homogen • Estimasi Jumlah Pengulangan • Dicari dengan rumus [(np-1) – (p-1)] ≥ 16 (n = jumlah pengulangan tiap perlakuan; p = jumlah perlakuan), maka didapatkan jumlah pengulangan yang dibutuhkan untuk tiap-tiap kelompok perlakuan adalah 4 • Untukmenghindarilose of sample,tiapkelompokdibeicadangan 2 ekortikus, kecualiuntuk K(+) yang memiliki 5 cadanganmengingat K(+) hanyadiberi DMBA tanpakelorsehinggatikusrentanmati

  19. HewanCoba cont.. • KriteriaInklusi • Strain wistar • Umur 2 bulan • Berat badan ± 200 gr • Jenis kelamin jantan • Dalam keadaan sehat selama penelitian • Kriteria Eksklusi • Tikus yang selama penelitian tidak mau makan, tikus yang kondisinya menurun, sakit dalam masa persiapan atau adaptasi

  20. VariabelPenelitian • VariabelBebas (Independent) • Ekstrak metanol daun kelor dengan dosis 20, 40, dan 80 mg/kg/hari • Variabel Tergantung (Dependent) • Ekspresi HSp25 dalamjaringankolontikus • VariabelKendali (Control) • Kriteriainklusi sample • Pemberian diet DMBA • Kondisi lingkungan kandang • Pemberian per oral ekstrakmetanol daun kelor dengan sonde

  21. LokasidanWaktuPenelitian • Eksperimen ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya pada bulanDesember 2011 sampai dengan Maret 2012.

  22. AlatdanBahanPenelitian Alat

  23. AlatdanBahanPenelitian cont.. Bahan • Bahan Makanan Tikus • Pakan tikus dewasa per ekor per hari adalah 50 gram adalah pakan normal dengan komposisi: comfeed PARS 53% dan tepung terigu 23,5 %, dan air 23,5 %. • DMBA • Ekstrak daun kelor (Moringa oleifera) • Didapatkan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol karena ekstrakmetanoldaunkelormemilikikandunganfenol total, flavonoid total, danefekantiradikalbebas yang lebihbaikdaripadamenggunakanpelarut lain (Jonathan et al, 2012). • Prinsip dari metode maserasi adalah mengekstrak senyawa dalam daun kelor tanpa menyebabkan kerusakan pada senyawa tersebut karena metode ini tidak menggunakan pemanasan dan dikerjakan dalam suhu ruangan. • Proses ekstraksi menggunakan 42 gram tepung daun kelor (Moringa oleifera) kemudianrendamdenganmetanol 96% sampai volume 900 ml, dikocok 30 menit lalu di biarkan semalam. Ambillapisanatascampuranmetanoldenganzataktif.Tunggusampaialiranmetanolberhentimenetespadalabupenampung (1,5 sampai 2 jam untuk 1 labu).Hasil yang diperolehkira-kirasepertigadaribahanalamkeringlaludisimpandalam freezer (LaboratoriumFarmakologi FKUB). • Bahan pemeriksaan immunohistokimia • Jaringan kolontikus, HSP25 dalamjaringan kolon, IHK kit unit.

  24. DefinisiOperasional • Pemberian per oral ekstrak metanol daun kelor (Moringa oleifera) • Perlakuan (Intervensi) adalah pemberian suplementasi ekstrakmetanoldaunkelor(Moringa oleifera) 20, 40, dan 80 mg/kg/hari dengan cara dimasukkan per oral dengan sonde • Tikus model karsinogenesiskolon • Tikus wistar diberi 10 mg/kg/hari 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) per oral (sonde) selama 45 hari. • Ekspresi HSP25 pada jaringan kolon • Ekspresi HSP25 pada jaringan kolon tikus adalah HSP25 yang diukur dengan metode IHK pada setiap kelompok tikus. Ekspresi HSP25 diukurdenganmenghitungbanyaknyasel yang mengekspresikan HSP25 yang ditandaidenganwarnacoklatdenganperbesaranmikroskop 400x sebanyak 10lapanganpandangpadasetiaptikus.

  25. AlurPenelitian

  26. PengukuranEkspresi HSP25Metode IHK • Persiapanjaringan. • Setelahdipisahkan, jaringankarsinogenesiskolondibuatsediaanparafin. Laludipotongsetebal 4-5µm, kemudianditetesi air dandikeringkandenganmemiringkankacaobjeksecaravertikaluntukmemediasiadesijaringanpadakacaobjek. Selainitujugadilakukanpemanasan slide selama 30 menitpadasuhu 60oC atau 37oC selamasatumalam. • Deparafinisasidanrehidrasimenggunakan: • Xylol1 10 menit, Xylol2 5 menit, sertaalkohol absolute, alkohol 95%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% selamamasing-masing 5 menit. Kemudiandibilasdengan PBS 3 kali selamamasing-masing 5 menitdandisekadengantisu. Laludiberi H2O2 3% selama 20 menitdandicucilagidengan PBS 3 kali selamamasing-masnig 5 menitdandikeringkandengantisu. • Blockingdengan BSA 1% selama 30 menituntukmencegahbereaksinyabahan endogen denganprosespewarnaanselanjutnyadibilasdengan PBS 3 kali masing-masing 5 menit.

  27. Metode IHK cont… • Pemberianantibodi primer HSP25 padasuhu 37oC selama 60 menit, lalubilasdengan PBS 3 kali masing-masingselama 5 menit. • Pemberianantibodisekunderselama 60 menitlaludibilaslagidengan PBS 2 kali selamamasing-masing 5 menit. • SA-HRP (Strep Avidin-horse radinperoxidase ) 60 menit, bilasdengan PBS 2 kali masing-masing 5 menit • DAB (DiamanoBenzidin ) + 20%, laludicucidenganaquades 5 menit • Control stainingdenganmayerhematoxylen 10 detik, laludicucidenganaquadessampaibersihdandikeringkandengantisu. • Mountingdenganetilendanditutupdengancover glass laludperiksadibawahmikroskop LaboratoriumFisiologi FKUB

  28. HasilPenelitian a b c d Ekspresi HSP25 , (metode IHK, perbesaran 400x) selberwarnacoklatditunjukantandapanah, a) K(-), kontrolnegatif; b) K(+), kontrolpositif (diet DMBA 10 mg/kg/hari); c) P1, Perlakuan 1 (DMBA + 20 mg/kg/hari); d) P2, Perlakuan 2 (DMBA + 40 mg/kg/hari); e) P3, Perlakuan 3 (DMBA + 80 mg/kg/hari) e

  29. Analisis data Ujinormalitas (metodeKolmogorov-Smirnov) p = 0,824(p > 0,05), data terdistribusi normal mengikutihakikatnaturalistikyaitu data tersebarmengikutipola natural tertentu Ujihomogenitasvarian (metodeLevene test) p = 0,198 (p > 0,05), data berasaldarivarian yang samaatauhomogen. UjiOne-way ANOVA p = 0,000 (p < 0,05). terdapat minimal duakelompok (subset) yang berbedasecarasignifikan.

  30. Terjadipenurunanekspresi HSP25 jaringankolonpadatikus yang diberiekstrakmetanoldaunkelorhinggadosis 40 mg/kg/hari (P2), namunpadadosis yang lebihtinggi, ekspresi HSP25 meningkatkembali.

  31. Pembahasan DMBA meningkatkanekspresi HSP25/27 • Metabolit DMBA menyebabkanterbentuknyaDNA adduct  mutasi DNA  pembentukanprotein mutan, mempoduksiprotein berlebih • Metabolit DMBA meningkatkanpembentukan ROS  stresoksidatif  potensiterjadikerusakan DNA, denaturasi protein meningkatkanbebankerja molekular chaperon (HSP) menginduksisintesis HSP25/27

  32. Moringaoleiferamenurunkanekspresi HSP 25/27 • Quercetinmenghambatfosforilasi HSF1  mencegahtranskripsiHSP25/27 • Flavonoidsebagaiantioksidan  meminimalisirpembentukan ROS  mengurangijumlahdenaturasi protein, mengurangikerusakan DNA akibatoksidasi (risikoterjadinyamutasiberkurang)

  33. Moringaoleiferameningkatkanekspresi HSP25/27 Quercetinmenghambatpertumbuhankankerdenganmenginhibisibermacam-macam protein kinase (Bolyet al, 2011) HSP25 dan protein kinase • HSF1 teraktifasitergantungdariasam amino mana yang terfosforilasi (aktifitas protein kinase) • Mengaktifkan HSF1 • c-Jun NH(2)-terminal protein kinase(JNK) (StephanoudanLatchman, 2010), • polo-like kinase 1 (PLK1) • calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) (Whiteselldan Lindquist, 2009). • Menginhibisiaktifasi HSF1 • glycogen synthasekinase 3 beta (GSK-3β), • extracellular signal-regulated kinase (ERK1) • isoform protein kinase C (PKC) (Whiteselldan Lindquist, 2009)

  34. Efekquercetintergantungdarikonsentrasinya • Quercetinkonsentrasitinggimenyebabkan: • >40µmol/L  sitotoksikdenganmenginduksiterbentuknya ROS stresoksidatifmenurunkanviabilitassel (Vargas dan Burg, 2010). • >100µmol/L  meningkatanfosforilasi JNK (Shih et al, 2004). • 40 mg/kg  meningkatkanfosforilasiCaMKII(Jungaet al, 2010). • 100 µmol/L  menurunkanfosforilasi PLK1 (Murtazaet al, 2006) • penurunan ERK1 secarabertahap (Granado-Serrano et al, 2006) • 120µmol/L  menurunkan PKC sitosolsecarabermakna (Kang dan Liang, 1997) • quercetintidakmenyababkanperubahan yang bermaknahinggakonsentrasi30µmol/LterhadapGSK-3β yang terfosforilasi (Gelebartet al, 2008), sedangkanpengaruhquercetinpadakonsentrasi yang lebihtinggibelumbanyakdieksplorasi.

  35. Quercetinkonsentrasitinggidan HSP25/27

  36. Kesimpulan • Ekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) mampumenurunkanjumlahsel yang mengekspresikan HSP25 padatikusWistar yang diinduksi DMBA hinggadosis 40mg/kg/hari. • Pemberianekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) dalamdosis yang lebihtinggi, yaitu 80mg/kg/harimenyebabkanpeningkatankembalijumlahsel yang mengekspresikan HSP25.

  37. Saran • PerludilakukanpenelitianlebihlanjutmengenaiberapabanyakkonsentrasiquercetinataupunflavonoidlainnyadalamjaringankolontikusWistar yang diinduksi DMBA padapemberianekstrakmetanoldaunkelor (Moringaoleifera) dalambeberapadosis. • Perludilakukanpenelitianmengenaihubunganantarajumlah HSF1 yang teraktifasidenganekspresi HSP25 padajaringankolontikusWistar yang diinduksi DMBA. • Penelitiankuantitatifperludilakukanuntukmengukur protein-protein kinase yang berperandalammengaktifasi HSF1 dan protein kinase yang menghambataktifasi HSF1 • Penelitianmengenaiseberapakuathubungan protein-protein kinasetersebutdengantingkataktifasi HSF1 danekspresi HSP25 danpadajaringankolontikusWistar yang diberi diet DMBA perludilakukan.

  38. TERIMA KASIH

More Related