La separazione di proteine si basa sulle loro proprietà fisiche:

1. La separazione di proteine si basa sulle loro proprietà fisiche: • Carica - Dato che molti aminoacidi sono carichi, noi possiamo utilizzare la carica netta di una proteina ad un particolare pH • Dimensione – (e.g. peso molecolare) Proteine hanno un range da pochi centinaia di Dalton fino a complessi sopra il milione • Polarità – Molti aminoacidi sono non polari e quindi alcune proteine sono molto idrofobiche • Specificità – Un interazione di una proteina per un ligando • Solubilità – Interazione proteina-solvente

3. Principali tecniche di separazione e purificazione di proteine Salting in Precipitazione Salting out Scambio ionico Cromatografia di assorbimento Assorbimento su composti inorganici Cromatografia per affinità HIC Cromatografia per interazioni idrofobiche Cromatografia per gel filtrazione Elettroforesi su gel Ultrafiltrazione

4. SOLUBILITA’ DELLE PROTEINE • La presenza di gruppi ionizzabili (acidi e basici) polari ed idrofobici presenti • sulla superficie di una proteina determina la sua solubilità, che dipende anche: • 1) dalla concentrazione dei sali disciolti nel mezzo; • 2) dalla polarità del solvente; • 3) dal pH; • 4) dalla temperatura. • Proteine diverse hanno, in determinate condizioni, valori di solubilità • profondamente diversi: alcune precipitano, altre restano in soluzione • Questa caratteristica viene utilizzata per la purificazione delle proteine.

5. Pre-purification Sometimes you need to pre-purify your protein in order to clean it before the first chromatographic step. Most used techniques are: • Ammonium sulfate precipitation: addition of saturated ammonium sulfate solution to a pH-stabilized protein mixture. Stop the addition before the precipitation of your protein. You have now to desalt, dialyze…..or hydrophobic interaction! • Heat precipitation: warm the lysate under slow but efficient stirring. Many protein will precipitate. The working temperature should be studied scarifying a bit of protein. For highly stable proteins (e.g Taq polymerase) 65°C can be reached • Batch cleaning: Addition of a medium which binds contaminants with opposite charge with respect to your protein.

6. Solubilità di una proteina + + zona idrofobiche - + - - + + + - + - - + + + - - + La distribuzione dei residui idrofilici e idrofobici alla superficie è il fattore che determina la solubilità nei vari solventi La solubilità di una proteina nel solvente acquoso è il risultato di interazioni polari con il solvente, con gli ioni dei sali in soluzione e delle forze repulsive tra molecole cariche dello stesso segno

7. 1. Effetti della concentrazione salina Forza ionica = I Ci = concentrazione molare della specie ionica i Zi = carica ionica L’effetto di ioni diversi dipende da: a) le dimensioni dello ione b) l’idratazione dello ione S/S’ = solubilità nella soluzione salina / solubilità in acqua pura della carbossi-emoglobina

8. Salting in A bassa concentrazione salina la solubilità delle proteine usualmente incrementa leggermente A bassa forza ionica le forze repulsive tra molecole di proteina, cariche dello stesso segno, sono insufficienti per tenere le molecole in soluzione diminuzione di solubilità precipitazione Al punto isoelettrico (I.E.P.) le cariche positive bilanciano le cariche negative e la repulsione elettrostatica è annullata. Questo è un motivo ulteriore di aggregazione e precipitazione

9. CARICA NETTA  PUNTO ISOELETTRICO CARICA NETTA  Ribonucleasi A

10. Salting in solubilità - - - - - - - - - pH > I.E.P. - + + + + + + + + pH < I.E.P. pH I.E.P + - + - + -+ - solubilità pH  I.E.P. pH < I.E.P. pH = I.E.P. forza ionica

11. Precipitazione: salting out Una molecola proteica in soluzione ha delle zone idrofobiche che entrano in contatto con le molecole di acqua. Queste vengono forzate a disporsi in maniera ordinata attorno alle catene laterali dei residui. + + - + - - + + + - + + + In presenza di elevata concentrazione salina gli ioni dei sali vengono solvatati e l’acqua rimossa dalla superficie proteica. Le zone idrofobiche restano esposte e possono interagire e dar luogo a aggregati e precipitazione (salting out)

13. Salting out Caratteristiche dei sali usati per la precipitazione: devono provocare deidratazione di zone idrofobiche senza interagire con la proteina Serie di Hofmeier per anioni: SO4 2-> CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->SCN- Cationi: NH4+>K+>Na+ Soluzione satura (NH4)2SO4 4M d=1.235 g/cm3 533 g/l soluzione 761 g sale + 1 l soluzione Il salting out è funzione della proteina e del sale utilizzato. Inoltre all’aumentare del PM della proteina la quantità di sale richiesto per la precipitazione diminuisce Pregi Economico e rapido Difetti Difficoltà di risolubilizzazione della proteina Bassa efficienza

14. proteina precipitata % 60 40 20 20 40 60 80 100 % sat. di (NH4)2SO4 Precipitazione frazionata Tecniche di precipitazione: aggiunta di sale solido aggiunta di soluzione satura Le frazioni proteiche, via via che precipitano, vengono separate per centrifugazione I precipitati vengono ridisciolti in soluzione tampone. L’eccesso di sale viene rimosso per dialisi

16. Dialisi Permette di rimuovere soluti a basso PM (sali, ad es.)

18. Ultrafiltrazione Permette di eliminare il solvente, concentrando il soluto ad alto PM Permette di rimuovere o cambiare i sali presenti nella soluzione

19. Effetto dei solventi organici • I solventi organici miscibili con l’acqua, come l’acetone e l’etanolo, • precipitano le proteine in quanto abbassano la costante dielettrica del • solvente, riducendone il potere di dissolvere ioni come le proteine. L’acqua di solvatazione viene rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine e quindi le proteine precipitano in ordine crescente, a seconda del n° di gruppi carichi presenti sulla loro superficie mentre aumenta la concentrazione di solvente organico. • Questo fenomeno può essere sfruttato come metodo di frazionamento, • però richiede temperature vicino allo zero, o inferiori, per evitare l’effetto • denaturante che i solventi organici hanno a temperature più alte. • L’abbassamento della costante dielettrica aumenta l’effetto del • SALTING OUTe quindi in alcuni casi può essere utile combinare le due • tecniche di precipitazione. • Alcuni solventi organici, come la N,N dimetilformamide (DMF) o • il dimetilsulfossido (DMSO), per via del valore elevato della loro costante • dielettrica, sono invece ottimi solventi delle proteine.

20. Cromatografia  Le tecniche cromatografiche permettono la separazione di soluti in base alla loro diversa capacità di ripartirsi tra 2 fasi (generalmente una fase solida e una liquida). Ne conseguono diverse mobilità lungo una colonna delle particelle di soluto in presenza di un fluido che fluisce nella colonna.  Rf è la mobilità del soluto rispetto al flusso di liquido (solvente)  L’interazione tra soluto (nel caso specifico proteine) e il materiale che costituisce la colonna fa “ritardare” il passaggio del soluto rispetto al solvente.  Soluti con Rf diverso possono essere separati completamente se la colonna è sufficientemente lunga e la diffusione non troppo alta. Scambio ionico Cromatografia di adsorbimento Assorbimento su composti inorganici Cromatografia per affinità HIC Cromatografia per interazioni idrofobiche Cromatografia per gel filtrazione

21. Cromatografia di Adsorbimento Un adsorbente può essere definito come un solido che ha proprietà di tener legate molecole alla sua superficie Caratteristiche del mezzo adsorbente: L’adsorbente deve avere una struttura aperta in modo che le molecole proteiche possano penetrare e raggiungere i siti di legame L’adsorbente deve interagire con la proteina senza danneggiarla Adsorbenti/supporti usati per le proteine: Cellulosa, destrosio, agarosio e polimeri sintetici Polimeri sintetici con leganti specifici (crom. per affinità) Sostanze inorganiche ( Ca10(PO4)6(OH)2) Supporto inerte (tipo cellulosa) con gruppi carichi non deve interagire fortemente con la proteina

22. Cromatografia per scambio ionico Le molecole vengono separate sulla base della loro carica totale Al supporto inerte sono legati gruppi carichi positivamente (scambio anionico) o negativamente (scambio cationico) Le cariche sono bilanciate da contro-ioni come ioni metallici, ioni cloruro e ioni del tampone Una molecola proteica può spiazzare il contro-ione e attaccarsi all’assorbente Il legame delle molecole è reversibile e queste possono essere eluite con un gradiente salino o di pH

23. DEAE = Diethylaminoethyl

24. Scelta delle resine e loro capacità adsorbenti Capacità adsorbente degli scambiatori A parità di tipo di supporto dipende dalle dimensioni della molecola proteica. La capacità aumenta al diminuire del PM con una relazione lineare tra log PM e capacità. Es: CM-cellulosa pH = 6 I = 0.01M PROTEINA PM Capacità (mg/ml) lisozima 14300 130 creatina chinasi 82000 35 aldolasi 160000 22 piruvato chinasi 228000 12.5

25. Supporti e scambiatori Supporti: cellulosa (microcristallina e non) granuli sferici di cellulosa (Sephacel) granuli sferici di destrano (Sephadex) agarosio (Sepharose) Scambiatori: DEAE = dietilamminoetil (-OC2H4N(C2H5)2) – carico fino a pH 9 QAE = dietil (2-idrossipropil)amminoetil – carico fino a pH 12 TEAE= trietilamminoetil CM = carbossimetil (-OCH2-COOH) – carico fino a pH 4 SP = sulfoprofil – carico fino a pH 2 Resine scambiatori di anioni Resine scambiatori di cationi pH ed effetto Donnan Il pH nell’intorno dello scambiatore non è lo stesso di quello del tampone applicato perché la matrice adsorbente può respingere o attrarre protoni

26. Adsorbimento del campione Condizioni di adsorbimento  La miscela di proteine, per essere caricata sulla colonna, deve essere nello stesso tampone usato per equilibrare la colonna, in particolare deve essere alle stesse condizioni di pH e f. ionica. Per raggiungere queste condizioni si possono utilizzare tecniche di dialisi, ultrafiltrazione o gel filtrazione  Concentrazione del campione Dimensioni della colonna  La concentrazione del campione e il suo volume determinano le dimensioni della colonna. La capacità dello scambiatore dipende dalle dimensioni delle molecole proteiche. Una colonna larga e corta ha un flusso molto veloce, ma il flusso può non essere omogeneo attraverso tutta la sezione. Una colonna lunga e sottile ha un flusso molto lento ma regolare lungo tutta la superficie. Lunghezza colonna: 4-5 volte il diam. Flusso 10-30 cm/h Superficie: 5 cm2 flusso 50-150 ml/h

27. Eluizione della proteina Metodi per eluire una proteina adsorbita:  Variazione di pH in modo da indebolire le interazioni tra molecola proteica e gruppo carico (abbassare pH per scambiatore anionico, aumentare pH per scambiatore cationico) Inconvenienti del metodo: precipitazione proteina  Incremento di f. ionica per indebolire le interazioni elettrostatiche fra proteina e gruppo carico. Si usano sali tipo KCl o NaCl. Gli ioni spiazzano le proteine, occupano i gruppi carichi e permettono alla proteina di fluire lungo la colonna.  L’eluizione viene effettuata applicando un gradiente salino; le proteine di una miscela vengono eluite separatamente, sulla base della loro diversa forza di interazione con lo scambiatore. Abs280 vol eluiz.

29. Applicazione del campione  Aggiustare pH e conducibilità dell’estratto proteico con piccole aggiunte di soluzione di Tris-HCl 0.2 M agli stessi valori di pH e conducibilità della colonna.  Caricare l’estratto sulla colonna.

30. proteina proteina + + + + - + + + + + + - - + - - - + - - + - + - + - + Adsorbimento su composti inorganici Assenza di soluzione tampone In presenza di tampone Adsorbenti: ossidi, idrossidi e fosfati. Un es.: idrossiapatite: Ca10(PO4)6(OH)2 Le molecole proteiche vengono adsorbite solo in superficie in un tampone fosfato 20mM e pH circa neutro. Capacità massima 0.1mg/cm3 Proteine cariche positivamente interagiscono con i gruppi PO4 3- e possono essere eluite da alta concentrazione di ioni Ca2+ Proteine cariche negativamente interagiscono con gli ioni Ca2+ e possono essere eluite con alta concentrazione di PO4 3- Si applica per lo più su DNA perché riesce a separare in maniera selettiva da DNA a doppio filamento da DNA a singolo filamento e RNA. (si eluisce il DNA con gradiente di tampone fosfato pH 7 che stacca prima il singolo filamento di DNA e poi il doppio filamento di DNA) -- - -

31. Cromatografia per affinità Si basa sulle proprietà di alcune proteine di legare in modo specifico, ma non covalente, un’altra molecola (coenzima, substrato, inibitore) Il legante specifico viene attaccato ad un gruppo funzionale sulla superficie del materiale di supporto. -CH2-CH2-CH2- agarosio legante specifico molecola proteica Il materiale di supporto deve essere un polimero poroso e idrofilo, in modo da permettere il libero accesso alle molecole ai siti di legame. Tipico polimero utilizzato: granuli sferici di agarosio. Il legante deve essere attaccato al supporto in modo da non alterare le interazioni con la proteina. Viene utilizzato un braccio spaziatore in modo da posizionare il legante lontano dal supporto e renderlo più accessibile alla proteina. Devono essere minime le interazioni aspecifiche di altre proteine con il legante Il legante deve essere stabile alle condizioni utilizzate durante la cromatografia.

32. Eluizione Eluizione: alta concentrazione di legante alta concentrazione salina (distrugge interazioni non idrofobiche) proteina legante il glucosio G G G G aggiunta di glucosio (G) colonna colonna G G Proteina eluita

35. Non possibile predire quale resina legherà una data proteina ma va determinato sperimentalmente

36. La miscela proteica è disciolta in alta forza ionica

37. l'HIC viene svolta con un solvente acquoso e con variazioni di forza ionica per eluire la colonna. Le proteine tipicamente si legano nella forma nativa attraverso gruppi idrofobici presenti sulla loro superficie. Lo stato nativo viene mantenuto durante le condizioni di eluizione. • La cromatografia a fase inversa puo’ utilizzare un solvente idrofobico (tipicamente acetonitrile) e il legame di un ligando è una funzione della partizione di fase tra la natura idrofobica del solvente e i gruppi funzionali idrofobici della colonna. Le proteine in questi solventi sono tipicamente denaturate e si legano grazie alla natura idrofobica su di un'intera sequenza polipeptidica. Dal momento che la maggior parte dei gruppi idrofobici sono localizzati nel core delle proteine globulari, il legame è possibile grazie alla denaturazione della proteina. le proteine possono essere purificate usando la cromatografia a fase inversa, ma solitamente devono essere rinaturate per riottenere la funzionalità.