Inmunoréplica tipo Western

1. Inmunoréplica tipo Western Mayo, 2013 Dra. Sobeida Sánchez Nieto

2. Western blot o inmunoréplicatipo Western • Es unatécnicaanalíticaqueesusadaparadetectarespecíficamente a lasproteínas de unamuestra, mediante el uso de anticuerpos. • La técnicanecesita la separacióninicial de la muestra a través de un un gel de poliacrilamida en el que se separaronprimerolasproteínasya sea en base a su peso molecular (PAGE-SDS, unadimensión) o bien en base a sucarga y peso molecular (PAGE-SDS; 1 o 2 dimensiones).

3. Transferencia de biomoléculas de soporte semisólido a sólido. • Técnica que fue descrita por Southern en 1975 para la transferencia de DNA en geles de agarosa a membranas de nitrocelulosa. • Después se utilizó para la transferencia de RNA a membranas, Northern. • Finalmente se transfirieron proteínas a membranas, Western.

5. Pasos para el Western • Separación de proteínas en gel de poliacrilamida. • Transferencia de las proteínas a la matriz sólida (membrana) • Tinción de proteínas en la membrana (opcional) • Bloqueo • Detección de la proteína de interés: • Reacción con el primer anticuerpo • Reacción con el segundo anticuerpo

6. 1. Separación de las proteínas en un gel de poliacrilamida-SDS

7. 2. Transferencia de proteínas Hay dos tipos de aparatos y por tanto de dos formas diferentes para transferir proteínas del gel al soporte sólido: • transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras que se llenan de amortiguador y • transferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámaras y por tanto no necesitan tal cantidad de amortiguador.

8. 1 2 1 2

9. Condiciones de transferencia: • Amortiguador de transferencia: 25 mMTris, 190 mMglicine, 20% MeOH, pH 8.0. Cuando son proteínas de alto peso molecular añadir 0.05% SDS. Corriente y tiempoaplicadopara la transferencia en cámarahúmeda

10. Ensamblar el sandwich Polo positivo Ojo! polo negativo

11. Añadir buffer Colocar en agitación

12. Proteínas

13. 3. Tinción de la membrana • Verificarquelasproteínasfuerontransferidas a la membranas. • Determinarsi los carrilesfueroncargados de manera similar. • Evaluar la eficiencia de la transferencia. • Identificarbandas de proteínasparaenviar a secuenciar. • Hay muchostipos de tincionesposibles, incluyendocolorantesorgánicoscomoRojo de Ponceau, amido black, fast green, azul de Coomasie, colorantesfluorescentes y particulascoloidales (oro, plata, cobre, hierro)

15. Tinción de proteínas en la membrana • Si la membrana se usaparatincióncolorimétrica (segundoanticuerpo) usar la tinción reversible de Rojo de Ponceau S. • Tinción en la queunasolución 0.1% de Rojo de Ponceau en 5% ácidoacético se dejapor 5 min. • Se visualizanlasbandas de proteína. • Remover el colorantelavando con aguahastaquelasbandasdesaparezcan (se puedeañadir 0.1 M NaOH), lavar y luegobloquear.

16. CalfliverproteinswerevisualizedafterelectroblottingtoImmobilon-P membranes: (A) Transillumination, (B) Coomassie™ Brilliant Blue, (C) Ponceau-S red, (D) Amidoblack and (E) CPTS total proteinstains. Lefttoright, molecular weightstandards and 12.2 μg, 6.1 μg, 3.1 μg of thelysate per lane. Membranes can be stored dry for long periods of time after proteins have been transferred with no ill effects to the membrane or the proteins (up to two weeks at 4°C; up to two months at -20°C; for longer periods at -70°C).

17. 4. Bloquear la membrana • La membrana puede unir proteínas • Proteínas como los anticuerpos o las de la muestra. • Para que no haya una unión inespecífica del anticuerpo en zonas en donde no hay proteínas (entre bandas) o bien que se una a proteínas que no son la de interés, se debe BLOQUEAR LA UNIÓN NO ESPECIFICA. • Para lograrlo se añade una solución diluida de proteína, la cual se une en todos los lugares en donde no hay proteína (allí más que en otros lados). • Por lo que el anticuerpo se une de manera preferencia a sitios en donde hay proteína con la conformación o aminoácidos blanco (proteína de interés). • Leche descremada, BSA, gelatina y a veces se añade Tritón o Nonidet (ambos detergentes)

18. 5. Detección • Directa Indirecta • Anticuerpo primario Anticuerpo primario • Marcado No marcado

19. Segundo anticuerpo conjugado con una enzima

20. Resultados • Múltiples bandas en el gel en el que se separaron las proteínas de las muestras • La detección de la proteína de interés, una sola banda

21. Anti-LDH b

22. Técnica colorimétrica • Segundo anticuerpo Anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina • Reactivos para fosfatasa, BCIP y NBT BC indoxyl intermediario Precipitado púrpura Sal de formazán insoluble. pp azul