Mutasi gen katG dalam Isolat Klinis Mycobacterium tuberculosis yang Resisten Isoniazid

1. Mutasi gen katG dalam Isolat Klinis Mycobacterium tuberculosis yang Resisten Isoniazid Oleh: Elfira Rosa Pane 20505008 Dosen Pembimbing Achmad Saifuddin Noer, Ph.D

2. Agenda 1. Pendahuluan - Latar Belakang - Tujuan Penelitian 2. Tinjauan Pustaka 3. Metode Penelitian 4. Hasil Penelitian dan Pembahasan 5. Kesimpulan

3. Latar Belakang • Ada Isolat Klinis yang Multi Drug Resisten terhadap Isoniazid dan Rifampin • Peneliti sebelumnya telah menemukan bahwa isolat klinis tersebut ada mutasi pada gen rpoB namun tidak ada mutasi S315T pada gen katG. pendahuluan

4. Tujuan penelitian • Mencari mutasi pada posisi selain asam amino S315, yang berkontribusi dalam resistensi terhadap isoniazid.

5. Tinjauan Pustaka Penyakit Tuberculosis (TB) : penyakit kronis; gejala: demam, batuk, sesak napas, nyeri dada, dan malaise (tidak nafsu makan) yang terjadi secara perlahan. Penyebab: infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bakteri berbentuk batang, lurus atau sedikit bengkok seperti kurva dengan panjang 2-4 mikro dan lebar 0,2-0,5 mikro Penularan: melalui udara

6. Mycobacterium tuberculosis • bakteri gram positif , sulit diwarnai, menahan zat warna dengan kuat dan tidak dapat dilunturkan walaupun dengan asam, sehingga disebut bakteri tahan asam • asam lemak (lipid), 20-40% dari keseluruhan berat kering, membuat bakteri ini resisten terhadap asam dan tahan terhadap antibiotik tinjauan pustaka

7. Pengobatan TBC Terapi TB : 6-9 bulan Resistensi terhadap obat TB karena meminum obat tidak sesuai dengan dosis yang dianjurkan. Resistensi bisa terjadi pada satu atau lebih obat anti TB (MDR-TB) isoniazid, rifampin, pyrazinamide, dan ethambutol tinjauan pustaka

8. Isoniazid • INH menginhibisi biosintesis asam mikolat pada dinding sel, sehingga mikobakteria menjadi lebih rentan terhadap reaksi dengan oksigen dan faktor lingkungan lainnya. tinjauan pustaka

9. Isoniazid • Isoniazid (INH) adalah prodrug, akan diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu asam nikotinat oleh enzim katalase peroksidase yang dikode oleh gen katG pada MTb • katG mengaktifkan INH, mutasi pada katG menyebabkan MTb resisten terhadap INH tinjauan pustaka

10. Katalase peroksidase • CPs: enzym yang tergantung heme • Melindungi bakteri dari molekul toksik (hidroperoksida) dan hidroksil radikal • Homotetramer, 80kDa • N-terminal: heme binding motif. tinjauan pustaka

11. Mutasi S315T • Mutasi titik yang paling banyak ditemukan adalah satu substitusi pada gen katG asam amino S315T(AGC→ACC) • memberikan keseimbangan yang optimal antara penurunan katalase dan aktifitas peroksidase yang cukup tinggi dalam katG • S315T mengganti sisi pengikatan INH dan/atau mempengaruhi transfer e- ke heme tinjauan pustaka

12. Metodologi Penelitian

13. Hasil penelitian hasil PCR menggunakan MAS PCR sepanjang 435pb dan 292pb: • Lajur 1 kontrol(-) • Lajur 2 kontrol + • Lajur 3 L10 • Lajur 4 L13 • Lajur 5 Marker pUC • Lajur 6 L14 • Lajur 7 L18 • Lajur 8 L4.

14. Hasil PCR gen katG sepanjang 435 pb: • Lajur 1 H37RV • Lajur 2 L18 • Lajur 3 Marker pUC • Lajur 4 L4 • Lajur 5 L10. hasil penelitian

15. Hasil Sequensing Isolat L10 • mutasi pada isolat klinis L10. (kiri→kanan) mutasi pada: kodon 316(GGC→TGC; Gly→Cys); kodon 317 (ATC→ATA; Ile→Ile); mutasi silence hasil penelitian

16. Hasil Sequensing Isolat L18 • mutasi pada isolat klinis L18, mutasi pada: kodon 316(GGC→TGC; Gly→Cys); kodon 317 (ATC→ATA; Ile→Ile): mutasi silence hasil penelitian

17. Pembahasan Isolat L10 dan L18, mutasi yang sama pada: kodon 316(GGC→TGC; Gly→Cys)

18. Gly 316 pembahasan

19. Akibat mutasi: • meningkatkan kerapatan (bulky) pada sisi yang termutasi, mengurangi akses masuk INH • perubahan konformasi enzim • mengurangi afinitas • mengganti/mengubah orientasi terikatnya INH pada sisi aktif enzim • mengurangi kemampuan enzim untuk secepatnya berinteraksi dengan obat. pembahasan

20. Kesimpulan Mutasi pada isolat klinis L10 dan L18, yaitu kodon 316(GGC→TGC; Gly→Cys) diperkirakan bertanggung jawab dalam mengurangi afinitas katalase peroksidase terhadap isoniazid sehingga hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi baru mengenai penyebab resistensi.

21. SekianTerima Kasih

23. DNA Strain M.tb resisten isoniazid: DNA M.Tb strain L4, L10, L13, L14, dan L18 yang digunakan untuk analisis menggunakan PCR, diperoleh atas kebaikan Ibu Hera Noviana (Mahasiswi S3, Kimia FMIPA ITB). • kontrol negative air bi-destilasi; • kontrol positif strain H37Rv. metode penelitian

24. PCR Sekuen primer yang digunakan adalah: • primer luar KF 5’-gCA gAT gAT ggg gCT gAT CTA Cg-3’, • primer luar KR 5’-AAC ggg TCC ggg ATg gTg-3’, • primer dalam terbalik katG315 5’-ATA CgA CCT CgA TgC CgC-3’ metode penelitian

25. Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2700 pada kondisi: Denaturasi awal 96 ˚C selama 3 menit, lima siklus 95 ˚C 1 menit, 62 ˚C 1 menit, dan 72˚C 30 detik, lima siklus 95 ˚C 1 menit, 60 ˚C 40 detik, dan 72˚C 30 detik, dua puluh dua siklus 94 ˚C 1 menit, 58 ˚C 40 detik, dan 72˚C 30 detik, elongasi akhir 72 ˚C selama 3 menit. metode penelitian

26. Elektroforesis gel agarose • Sebanyak 5μL fragmen hasil amplifikasi dielektroforesis pada Gel agarose dengan konsentrasi 1,5% dalam 40 mL TAE dan visualisasi di bawah lampu UV.

27. Sequensing: DNA sepanjang 435 pb yang telah di perbanyak, dikirim ke Macrogen Korea untuk sequensing.