Podsumowanie

1. Podsumowanie • Wirusy jako wektory • Ekspresja przejściowa z wykorzystaniem wektora wirusowego • Przykłady wirusów roślinnych funkcjonujących jako wektory: • Wirus mozaiki stokłosy BMV • Wirus tytoniu TRV • 4. Wyciszanie genów przy pomocy wirusa TRV • 5. Geny markerowe w konstrukcie genowym • Geny selekcyjne • Geny reporterowe • 6. Cechy genu reporterowego • 7. Białka reporterowe i ich zastosowanie ( GUS, GFP, lucyferaza) • 8. Techniki wykrywania GMO • PCR • Immunodetekcja ( ELISA) • Obecność terminatora • Odporność na antybiotyki i herbicydy – przykłady • Detoksykacja • Stymulacja rozwoju in vitro • Modyfikacja węglowodanów

2. Wirusy jako wektory Ekspresja przejściowa – wprowadzenie genu do ukształtowanego organizmu i dostarczenie go do wielu komórek i tkanek za pomocą zmodyfikowanych wirusów. • +Łatwość infekcji • +Duża ilość wbudowywanych kopii = wysoka ekspresja wprowadzanych genów • +Dowolny moment infekcji podczas rozwoju rośliny • - Limitowana wielkość wprowadzanego DNA (0,8 kpz) • Infekcja wirusowa może być letalna dla komórek gospodarza • Błędna synteza wirusowego RNA = błędna ekspresja wprowadzanych genów

3. Przejściowa ekspresja obcych genów przy użyciu wektora wirusowego Możliwość produkcji dużej ilości białek (synteza produktu z obcego genu 0,4-2% rozpuszczalnych białek rośliny).

4. Wyciszanie genów metodą VIGS (VirusInducedGeneSilencing) • Wirus TRV tytoniu z dwudzielnym genomem: RNA1 i RNA2; • RNA1 – zawiera replikazę, sekwencję kodującą movement protein i białko bogate w cysteinę • RNA2 – białka płaszcza i dwa białka strukturalne, które nie są niezbędne do funkcjonowania wirusa; • W miejsce sekwencji kodującej białko strukturalne wstawiono fragment z miejscami restrykcyjnymi do klonowania obcego DNA; • Mieszaniną komórek bakteryjnych Agrobacterium z TRV- RNA1 i TRV-RNA2 infekowano liście pomidora, a odtworzony wirus rozprzestrzeniał się i przenosił sekwencję wprowadzoną w jego MCS. *Wyciszenie genu syntazyfitoenu– kluczowego enzymu syntezy karotenoidów

5. Geny markerowe ułatwiają szybkie rozpoznanie transformantów i zmniejszają ryzyko regenerowania roślin mozaikowych zawierających komórki stransformowane i nie transformowane; • Geny selekcyjne • Geny reporterowe Geny markerowe nadają komórkom zdolność do podziałów i regeneracji roślin na pożywce zawierającej antybiotyk (zwykle kanamycynę lub higromycynę) lub herbicyd (zwykle preparaty Basta lub Round-up) i w związku z tym toksycznej dla komórek dzikiego typu (nie transformowanych). Geny selekcyjne geny reporterowe, zwane też wizualizującymi, powodują zmiany w wyglądzie i składzie chemicznym roślin - zwykle gromadzenie jakiegoś barwnika (tak działa gen β-glukuronidazyczyli GUS) lub świecenie (geny lucyferazy z bakterii - LUX lub owadów świetlików - LUC Geny reporterowe

6. Przykłady genów reporterowych

7. Techniki detekcji GMO • PCR – analiza kwasów nukleinowych (materiał świeży całe rośliny, organy) • Immunodetekcja - analiza produktów białkowych transgenu (materiał przetworzony); ELISA- test immunoenzymatyczny (ang. enzymelinkedimmunosorbentassay) • Obecność terminatora np. E9 3’ z genu małej podjednostki Rubisco z grochu, terminator genu syntazynopalinowej z Agrobacterium • Analiza odporności na antybiotyki lub herbicycynp. gen bla –kodujący β-laktamazęzapewniającą odporność na ampicylinę i penicylinę, gen Tn5 – kanamycynę; bar/pat- acylotransferezafosfinotrycyny – nadaje odporność na wiele herbicydów np. Basta, Ignite, Liberty.

8. Selekcja GM na podstawie detoksykacji Geny kodujące enzymy zdolne do przekształcania substancji toksycznych w ich nietoksyczne pochodne. DOG R1 – produkuje fosfatazę 2- deoksyglukozylo-6-fosforanową, która katalizuje przemianę szkodliwego dla roślin fosforanu 2-deoksyglukozy w 2-deoksygukozę

9. Modyfikacja węglowodanów Wykorzystanie do selekcji węglowodanów: Gen izomerazy fosfomannozypmi- umożliwia zmianę 6-fosforanu mannozy do 6 fosforanu glukozy, który jest łatwo metabolizowany przez rośliny. Selekcję opartą na wprowadzeniu genu pmizastosowano u roślin jedno i dwuliściennych (pszenicy, kukurydzy, buraku cukrowym, ogórku i drzewach owocowych) xylA- katalizuje przekształcenie ksylozy w D-ksylulozę, która może być wykorzystana jako źródło C przez komórki roślinne; selekcja z wykorzystaniem ksylozy sprawdziła się u tytoniu, pomidora i ziemniaka, a wydajność transformacji była wyższa niż przy użyciu wektora z genem nptII.