1 / 32

Nataša Vučković Opavski Institut za mikrobiologiju i imunologiju Medicinski fakultet Beograd

Savremene metode za tipizaciju grupe A streptokoka i distribucija serotipova i genotipova u Srbiji u periodu od 1991. do 2007. godine. Nataša Vučković Opavski Institut za mikrobiologiju i imunologiju Medicinski fakultet Beograd. Streptococcus pyogenes.

dugan
Download Presentation

Nataša Vučković Opavski Institut za mikrobiologiju i imunologiju Medicinski fakultet Beograd

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Savremene metode za tipizaciju grupe A streptokoka i distribucija serotipova i genotipova u Srbiji u periodu od 1991. do 2007. godine Nataša Vučković Opavski Institut za mikrobiologiju i imunologiju Medicinski fakultet Beograd

  2. Streptococcus pyogenes • S.pyogenes = grupa A streptokoka (GAS) je vrlo važan član roda Streptococcus • Isključivo je patogen ljudi; prenosi se respiratornim kapima ili direktno, preko inficiranih rana • Kolonizuje gušu i kožu • Najčešće izaziva neinvazivne infekcije • guše i kože; sporadični slučajevi teških • invazivnih bolesti sa visokim procentom • mortaliteta

  3. Streptococcus pyogenes • Spektar infekcija se kreće od blagih do teških: • - faringitis, impetigo, šarlah • - bakterijemija, pneumonija, meningitis, nekrotizirajući • fasciitis (NF), streptokokni toksični šok sindrom (STŠS) • Klinički tok invazivnih bolesti – STŠS i NF je vrlo dramatičan • sa visokom stopom letaliteta

  4. Streptococcus pyogenes • GAS je vrlo važan uzročnik morbiditeta i mortaliteta ljudi • širom sveta (procena je 517,000 smrtnih ishoda svake godine) • U Evropi je prosečna godišnja stopa incidence invazivnih • bolesti izazvanih GAS 0,3-3/100.000 (StrepEURO, 2003-04.) • U SADje prosečna godišnja stopa incidenceinvazivnih • bolesti izazvanih GAS bila: 3,2-3,9/100.000 (CDC, 2008.)

  5. Streptococcus pyogenes • Mortalitet • Evropa: 20% (50% STSS i 25% NF) • SAD: 10 -15% (32% STSS i 25% NF) • Najviša incidenca invazivnih oboljenja je među osobama ≥65 godina (9.4 slučaja na 100,000 ljudi) i kod dece <1 godine starosti (5.3 slučaja na 100,000 ljudi)

  6. Streptococcus pyogenes Strategije kontrole • -laktamskiantibtiocisulek izbora • Vakcinacija • - 26-valentna vakcina; u 2. fazi kliničkih ispitivanja • Praćenje trendova u epidemiologiji oboljenja GAS preko tipizacije sojeva • Za epidemiološke studije, laboratorijska istraživanja i razvoj vakcije je od izuzetnog značaja tačna tipizacija izolata GAS

  7. Metode tipizacije S. pyogenes • Tipizacija M-proteina • Tipizacija T-proteina • OF-tipizacija • emm tipizacija • PFGE • Multilocus sequence typing (MLST) Klasićna karakterizacija - fenotipske metode Molekularne metode – genotipizacija

  8. Streptococcus pyogenes Tipizacija M proteina - M serotipizacija • Dr. Rebecca Lancefield je 1928.god. napravila sistem za tipizaciju grupe A streptokoka (GAS) koji bazira na varijabilnim antigenskim karakteristikama • termostabilnog površnog proteina. Rebecca Craighill Lancefield (1895-1981) Metoda po Lancefield-ovoj bazira na tretmanu kulture GAS u Todd-Hewitt bujonu, ključalom HCl. Prečišćeni ekstrakt je korišćen u testu kapilarne precipitacije da bi se odredio tip M proteina GAS. Na osnovu ekspresije M antigena je napravljena klasifikacija GAS.

  9. M protein – glavni faktor virulencije • Sastoji se od4 regiona: • Hipervarijabilnog (N-terminus – A podjedinice) određuju specifičnost serotipa • Varijabilni (B-podjedinice) • Konzervirani (C i D podjedinice ) • Antigenske razlike u hipervarijabilnom regionu predstavljaju osnovu za serološku klasifikaciju GAS po Lancefield - ovoj • 83 specifična i potvrđena M tipa, označena brojevima 1 – 93 M tipovi 7, 10, 16, 20, 21, 35, 45 ne postoje • Antitela specifična na jedan tip ne daju zaštitu u odnosu na druge Smatran “zlatnim standardom”

  10. M tipizacija Problemi vezani za M serotipizaciju: • ograničena dostupnost antiseruma za M tipizaciju(komplikovana i skupa priprema) • pojava novih M tipova (visok stepen “netipabilnosti”) • teškoće u interpretaciji Samo nekoliko referentnih laboratorija u svetu radi M serotipizaciju • Važna za potvrdu novih tipova

  11. Tipizacija T proteina – T tipizacija • Bazira na reakciji aglutinacije suspenzije bakterija, digestirane tripsinom, sa zečjim, tipski specifičnim antiserumom za T protein • Antiserumi su komercijalno dostupni • Postoji oko 30 T tipova • Jedan soj GAS može imati više od jednog T tipa - T pattern (T profil) • Na osnovu poznavanja T tipa/T patterna je moguće predvideti M tip

  12. OF tipizacija • ~50% sojeva S.pyogenesprodukuje faktor zamućenja - apoproteinazu– površni protein, koji funkcioniše kao enzim i koji reaguje sa lipoproteinima u serumu sisara, dovodi do povećanja zamućenja seruma • Soj GAS može biti ili OF pozitivan ili OF negativan i korelira sa M tipom • OF enzimi su OF tipski specifični, jer svaki M tip koji produkuje OF može indukovati tipski specifična antitela koja se mogu koristiti u testu inhibicije OF

  13. T tipizacija i OF tipizacija • Iako nisu tako specifične metode kao M tipizacija, T tipizacija i OF tipizacija predstavljaju vredne tehnike zbog mogućnosti da se efikasno i relativno jeftino predvidi M/emm tip

  14. Potreba za novim sistemom za tipizaciju • Ponovna pojava reumatske groznice i pojava teških infekcija izazvanih GAS tokom 1980tih i 1990tih, sa visokim procentom sojeva koje nije bilo moguće tipizirati M serotipizacijom, je ukazala na potrebu za preispitivanjem strategija tipizacije GAS • Pravljenje antiseruma za M tipizaciju je vrlo zahtevno i skupo

  15. Potreba za novim sistemom za tipizaciju • Okretanje ka neserološkim sistemima tipizacije i uvođenje tehnike sekvencioniranja gena koji kodira sintezu M proteina (emm gena) emmtipizacija

  16. mga fcrA emm enn scpA Streptococcus pyogenesorganizacija vir-regulona mrp sph velikivir-regulon Gen za M protein (centralni gen) Regulator C5a peptidaza superfamilija emm gena Superfamilija emm gena – sastoji se od više od 20 gena koji kodiraju M i M-like proteine, koji imaju svojstvo vezivanja za Ig; Svaki soj GAS ne mora imati ceo set ovih gena. Na osnovu broja i organizacije emm subfamilije gena, postoji 5 glavnih emm hromozomskih profila (pattern-a) (A-E).

  17. emm tipizacija • emm sekvencioniranje se zasniva na određivanju sekvence ~ 200 baznih parova na 5‘ kraju emm gena (centralni gen u superfamiliji emm gena) • emm tipizacija se zasniva na upotrebi dva vrlo konzervirana prajmera, kako bi se umnožio veći deo emm gena Metoda je opisana1990tih god. Kaufhold et al.FEMS Microbiol Lett 1994;119:19-26 Whatmore et al. Mol Microbiol 1994;14:619-631 Beall et al. J Clin Microbiol 1996;34:953-8

  18. www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/strepindex.htm • Website koji održava CDC (Centres for Diseases and Control and Prevention) • Baza podataka, koja se može pretraživati i koja sadrži podatke o svim potvrđenim emm tipovima i podtipovima, kao i privremenim tipovima i podtipovima • Karaktersitike sajta: • Određivanje tipa i subtipa posle sekvencioniranja u lab • Pretraživanje tipova • Protokoli • Publikacije • U bazu podataka se neprekidno dodaju sekvence gena novih emmtipova (privremeni tipovi „st“)

  19. emm tipizacija Definicija tipa se zasniva na identifikaciji 90 baza koji kodiraju 30 aminokiselina smeštenih na N terminalnom delu M proteina Određivanje emm tipa/podtipa • Poređenje sa bazom podataka CDC Poređenje dobijenih sekvenci sa referentnim sekvencama korišćenjem baze podataka CDC www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep • Princip • > 92% homologije sa 90bp – tip • bilo koja izmena u prvih 150bp – podtip

  20. emm tipizacija U ovom trenutku postoji više od 110 zvanično definisanih emm tipova (emm-1 do emm-124) emm tipovi se dalje dele na subtipove na osnovu minornih varijacija u sekvencama 150 baza (kodiraju 50 AK) unutar tipski specifičnog hipervarijabilnog regiona emm gena. Momentalno postoji preko 800 emm subtipova.

  21. emm tipizacija Postoji skoro uvek 1:1 odnos između 5‘emm tipa sekvence i M serotipa, tj. M tip korelira sa emm tipom

  22. Korelacija između M, emm, OF i T tipova Primer je dat na prvih 9 M tipova

  23. Zaključci studije eksterne kontrole kvaliteta ...koja je izvedena da bi se procenila karakterizacija GAS u 11 strep - EURO i 7 drugih streptokoknih referentnih centara • Sekvencioniranje emm gena se koristi u većini centara, obezbeđujući visok stepen tipizacije sojeva i izuzetnu podudarnost rezultata • Sekvencioniranje emm gena se pokazalo kao visoko precizna i pouzdana metoda i idealna alternativa M tipizaciji. Za karakterizaciju sojeva su od velikog značaja i fenotipske metode – T tipizacija i OF tipizacija. International Quality Assurance Study for Characterization of Streptococcus pyogenes. Members of the Strep-EURO Study Group and International Streptococcus Reference Laboratories and Androulla Efstratiou; Journal of Clinical Microbiology, 2007, 45:1175–1179.

  24. Molekularna tipizacija sojeva Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) – elektroforeza u pulsnom polju 2. Liza ćelija 1. Suspenzija ćelija Bakterijska ćelija Intaktne bakterijske ćelije uronjene u agarozu 3. Digestija DNK, restrikcionim enzimima 4. elektroforeza Intaktna bakterijska DNK suspendovana u agarozi Fragmenti bakterijske DNK suspendovani u agarozi PFGE se zasniva na upoređivanju profila DNK fragmenata u agaroza gelu

  25. Molekularna tipizacija soja Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) • 291 kb • 194 • 145.5 • 97 • 48.5 PFGE se zasniva na nekarakterističnim razlikama u genomu između izolata jedne bakteriijske vrste. Genetske varijacije koje se registruju ovom metodom se akumuliraju relativno brzo, te je vrlo pogodna za kratkoročne epidemijske studije.

  26. MLST-tipizacijaS. pyogenes • Analiza razlika u 7 “housekeeping” enzima, tj. gena koji kodiraju te enzime • “Housekeeping” geni su prisutni u svakom organizmu. Visoko su konzervirani, a njihovi produkti su od vitalnog značaja za svaki organizam • Mutacije u njima su selektivno neutralne • Variajacije u ovim genima se akumuliraju relativno sporo – pogodno za dugoročne epidemiološke studije (analiza evolucije klonova) Enright, M.C. et al. Infect. Immun. 69, 2416-27 (2001)www.mlst.net

  27. MLST-tipizacijaS. pyogenes Postoje dve metode: • MLEE - multilocus enzyme electrophoresis – analiza razlika u elektroforetskoj pokretljivosti “housekeeping” enzima • MLST – multilocus sequence typing – analiza razlika sekvenci gena koji kodiraju 7 “housekeeping”enzima

  28. Molekularna tipizacija sojeva Multilocus Sequence Typing (MLST) DNK bakterijskog hromozoma PCR umnožavanje – fragmenti vel.450 bp 7 housekeeping gena 7 GAS housekeeping gena: • gki (glucose kinase) • gtr (glutamine transporter protein) • murI (glutamate racemase) • mutS (DNA mismatch repair protein) • recP (transketolase) • xpt (xanthine phosphoribosyl transferase) • yqiL (acetyl-CoA acetyltransferase 1. Sekvencioniranje 7 genskih fragmenata sa oba lanca 2. Upoređivanje sekvenci svakog genskog fragmenta sa poznatim alelima u lokusu 3. Označavanje alelela u 7 lokusa da bi se dobio alelni profil 4. Upoređivanje alelnih profila sa profilima izolata u centralnoi bazi podataka putem interneta

  29. Multilocus Sequence Typing (MLST) Za svaki od 7 gena se svaka različita sekvenca označava određenim alelnim brojem i svaki izolat se definiše kao serija 7 brojeva - alelni profil, koji definiše tip sekvence - sequence type (ST) Izolati sa identičnim alelnim profilom imaju isti sequence type (ST) >aroe GAAGCGAGTGACTTGGCAGAAACAGTGGCCAATATTCGTCGCTACCAGATGTTTGGCA TCAATCTGTCCATGCCCTATAAGGAGCAGGTGATTCCTTATTTGGATGAGCTGAGCGAT GAAGCGCGCTTGATTGGTGCGGTTAATACGGTTGTCAATGAGAATGGCAATTTAATTG GATATAATACAGATGGCAAGGGATTTTTTAAGTGCTTGCCTTCTTTTACAATTTCAGGT AAAAAGATGACCCTGCTGGGTGCAGGTGGTGCGGCTAAATCAATCTTGGCACAGGCTA TTTTGGATGGCGTCAGTCAGATTTCGGTCTTTGTTCGTTCCGTTTCTATGGAAAAAACAA GACCTTACCTAGACAAGTTACAGGAGCAGACAGGCTTTAAAGTGGATTTGTGT >gdh AGAACACTTTATCCGTGGACAATACCGCTCTGGTAAGATTGATGGCATGAAATACATCT CTTATCGTAGCGAACCAAATGTGAATCCAGAATCAACAACTGAAACCTTTACATCTGGTG CCTTCTTTGTAGACAGCGATCGATTCCGTGGTGTTCCTTTCTTTTTCCGTACAGGTAAAC GACTGACTGAAAAAGGAACTCATGTCAACATCGTCTTTAAACAAATGGATTCTATCTTTG GAGAACCACTTGCTCCAAATATTTTGACCATCTATATTCAACCAACAGAAGGCTTCTCT CTTAGCCTAAATGGGAAGCAAGTAGGAGAAGAATTTAACTTGGCTCCTAACTCACTTGA TTATCGTACAGACGCGACTGCAACTGGTGCTTCTCCAGAACCATACGAGAAATTGATTT ATGATGTCCTAAATAACAACTCAACTAACTTTAGCCACTGGGAT 1. 4. Primer: Alelni profil:aroe_8 gdh_13 gki_13 recP_4 spi_17 xpt_4 ddl_14 Streptococcus pneumoniae – Po završenom sekvencioniranju svih 7 gena se šalje zahtev na sajt http://www.mlst.net/databases . Dobijeni alelni profiil je Za ovaj soj je sequence type (ST) 199

  30. Najčešći M/emm tipovi izazivači faringitisa u Srbiji Zamena M/emm tipova – M11/M18 su zamenjeni tipovima M/emm1 i M/emm 3 Pojava novih emm tipova (M/emm 28, M/emm 50 i M/emm 58)

  31. Distribucija emm tipova GAS izolovanih iz faringsa i kože u Srbiji (2001-2007) Faringealni izolati – 93% izolata pripada najčešćim 8 emm tipovima Infekcije kože – 63% izolata pripada 10 emm tipovima; 37% izolata pripada 21 emm tipu

  32. Zakljućak • Tokom 17-godišnjeg perioda je došlo do zamene nekih M/emm • Postoji heterogenost tipova GAS u Srbiji (posebno kožnih izolata) • Postoje značajne razlike u distribuciji emm tipova faringealnih i kožnih izolata • Uopšteno, ukupna distribucija najčešćih faringealnihemm tipova u Srbiji odgovara podacima iz drugih zemalja

More Related