1 / 52

Molek ü l e r T estlerde Preanalitik F az

Molek ü l e r T estlerde Preanalitik F az. Prof. Dr. Abdulkerim B EDİR Ondokuz May ı s Ü niversitesi Samsun 201 4. Lab D ö ng üsü. Tıbbi / Cerrahi Pro sedürler. Edinim/ Acquisition. İşlem / Pro ses. Bilimsel Anal iz. Artanı Stoklama. Hasta. Saklama. D ağıtım.

dylan-hunt
Download Presentation

Molek ü l e r T estlerde Preanalitik F az

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Moleküler TestlerdePreanalitikFaz Prof. Dr. Abdulkerim BEDİR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Samsun 2014

  2. LabDöngüsü

  3. Tıbbi/ Cerrahi Prosedürler Edinim/ Acquisition İşlem/ Proses Bilimsel Analiz Artanı Stoklama Hasta Saklama Dağıtım Biyospesmen and süreç Biyospesmen Bilgilerinin Derleme ve Analizi Bilimsel Bilgilerin Derleme ve Analizi Klinik/KlinikAraştırma Çıktıları

  4. Moleküler Amaç Genomics Proteomics Metabolomics 1-Teşhis etmek 2-Tedavi belirlemek 3-Risk analizi Yüksekkalitede Biyospesmenlerebağlıdır

  5. Moleküler İdeal Yarın Bugün

  6. Moleküler Evren

  7. Moleküler Doğma

  8. Moleküler Akış

  9. Preanalitikfaktörler I: SıvıBiyospesmen • Antikoagülanlar • Sitrat-DNA, RNA • EDTA-DNA • Heparin-Sitolojik testler • Stabilizör/İnhibitörler • Protein: • Proteaz inhibitörleri • RNA: • Beta-merkaptoetanol (stabilizör) • RNaz inhibitörleri • DNA: • Stabildir-Örn. Guthrie testi • Saklama sıcaklığı

  10. Bekleme süresi • Hücre sayımı 24 saatte düşer • Sterilite • Bakteriyalkontaminasyon • Fungalkontaminasyon • Endojenbozucu etkenler • Enzimler: Proteazlar, DNazlar, RNazlar • Hücre ölümü • Numune tüpleri/kapları • DNaz-free • RNaz-free • Steril

  11. Antikoagulanlar

  12. Preanalitikfaktörler II:Solid Biyospesmen • Kanser hücrelerinde genomik değişiklikler düşük frekanstadır • Kantite sorunu • Biyopsi materyali • Kalite sorunu • Biyopsi materyalleri formalinlefiksedir. • DNA izolasyonu özel protokole tabidir • Pürite sorunu (Tümör heterogenitesi) • Normal hücreler ile karışıktır • Kanserin kendisinde heterogenite (farklı klonlar)

  13. FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) örnekler • Fiksasyon süresi • Parafine gömme sıcaklığı • Doku takip işlemi • Parafin blokları saklama şartları • DNA intak değildir • Kovalenaddükler oluşur • PCR 300 bp fragman

  14. Taze doku örnekleri • Patolog gözetiminde çalışılmalıdır • İnce iğne biyopsi materyalleri • Hücre sayısı yetersiz olabilir

  15. Saklamakoşulları- DNA • Numuneler • Kan, Kemik iliği, Vücut sıvıları • <1 gün, 23°C; 3 gün, 4°C • WBC, >1 year, -20°C or -70°C • Doku • <1 gün, 4°C • >2 hafta, -20°C • >2 yıl, -70°C • Izole DNA • <26 hafta, 2-25°C • 1-3 yıl, 4°C (Southern blot için 1 yıl) • <7 yıl, -20°C, -70°C (not frost-free)

  16. Saklamakoşulları- RNA • Numuneler • Kan, Kemik iliği, vücut sıvıları • <2 saat, 23°C or 4°C • 5 gün, 23°C; 7 gün 4°C denaturan’da • 1-2 hafta, -70°C denaturan’da • WBC, 2-4 hafta, -20°C; >6 ay, -70°C • Doku • <2 saat, 4°C • snap frozen, -70°C, >2 yıl • nitrogen vapor -140°C– -150°C, >2 years • Izole RNA • <30 gün, -20°C DEPC-treated su içinde • <30 gün, -70°C DEPC-treated su içinde • >6 ay, -70°C ethanol içinde

  17. PreanalitikfaktörlerIII:Moleküler lab • Benç ve ekipmanlar • Fizik alan olarak ayrı bir laboratuvar olmalı • Tek-yönlü iş akışı olmalı • Laminerflow kabin kullanılmalı • Eldivensiz çalışılmamalı • Giriş-çıkışlar sınırlı olmalı • Ekipman ve malzemeler laboratuvara özel olmalı; asla dışarı çıkarılmamalı • DNaz-free ve RNaz-free çalışma ortamı sağlanmalı • RNase ZAP (yüzey dekontaminasyonu), • RNase AWAY (plastik ve cam malzemeler) gibi solüsyonlar kullanılabilir

  18. Sarflar • Filtreli pipet ucu kullanılmalı • DNaz-free ve RNaz-free sertifikalı olmalı • Cam malzemeler 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC)ile yıkanmalı • Reaktifler • Otoklav yetersizdir • Kimyasal ve sarflar, DNaz-freeve RNaz-free sertifikalı olmalı, • DEPC iyi bir RNaz inhibitörüdür • Su, reaktif ve solusyonlar mutlaka DEPC içermeli, • 0.05–0.1% DEPC ilave edilebilir (Tris ve EDTA tamponlar hariç)

  19. Reaksiyonlar • Cross-kontaminasyon önlenmeli • RNasineklenmeli • Blank tüp/kuyu kullanılmalı • İnternal kontrol kullanılmalı • Mümkünse kapalı sistemler tercih edilmeli • Lab temizliği • Çalışma öncesi kabinlerde UV kullanılmalı • Her çalışmadan sonra dekontaminasyon yapılmalı • Yüzeyler önce %10 hipoklorit sonra %70 etanol ile • RNazkontaminasyonu düzenli kontrol edilmeli • RNaseAlert kit • Wipe test

  20. İş-akışı

  21. Çözüm-Otomasyon • MagNA Pure (Roche) • MolecularBiology Workstation (Tecan) • BioRobot(Qiagen) • NucliSENS(BioMerieux) • Viper system (BD)

  22. TECAN NucliSENS MagNA Pure BioRobot

  23. Viper

  24. Platformlar-DNA • Ekstraksiyon/Pürifikasyon • Array-CGH • CGH • Dizi analizi • Elektroforez • FISH • Insituhibridizasyon • PCR/LCR/RT-PCR/RFLP • SNP assay • Doku mikroarray

  25. Platformlar-RNA • Ekstraksiyon/Pürifikasyon • cDNAmikroarray • Insituhibridization • Elektroforez • Northernblot analizi • RT-PCR • Doku mikroarray

  26. Platformlar-Protein • Ekstraksiyon/Pürifikasyon • 1D/2D gel elektroforezleri • Antikor mikroarray • İmmunohistokimya • Kütle spektrometre • MALDI-TOF • SELDI-TOF • Doku mikroarray • Western blot analizi

  27. Preanalitikfaktörler IV:Edinim (Acquisition)

  28. Edinim (Acquisition) Warmiskemi (Intra-op) Coldiskemi (Post-op)

  29. Background Warmiskemi Coldiskemi

  30. Background

  31. EU SPIDIA PROJESİ Standardization and Improvement of Generic Pre-analytical Tools and Procedures for InVitroDiagnostics

  32. Sistematik-SPREC-01 Standard PreanalyticalCoding for Biospecimens Cancer EpidemiologyBiomarkers and Prevention2010;19:1004-11

  33. Örnekler

  34. Problemler

  35. FFPE vesaklamakoşulları J HistochemCytochem. 2011 April; 59(4): 356–365.

  36. Warmiskemi ve gen ekspresyonu Contribution of WIMA and WIRD to changes in gene expression within different time periods. Yi Ma , et al., Analytical Biochemistry Volume 423, Issue 2 2012 229 - 235

  37. Coldiskemi ve gen ekspresyonu Genlerin yaklaşık % 20-25’i ilk 30 dakikada etkilenmiştir (AffymetrixcDNAmicroarray) Sprüssel et al, BioTechniques 2004

  38. Coldiskemi ve protein ekspresyonu Proteinlerin yaklaşık %25-30’u ilk 30 dakikada etkilenmiştir (SELDI-TOF)

  39. ColdiskemiveIHC/FISH sonuçları

  40. Biyopsi lokasyonu ve kolon kanserde protein ekspresyonu • Proteinlerin yaklaşık %40’ı tümör bölgesine göre değişim göstermiştir

  41. Biyopsi lokasyonu ve kolon kanserdeVEGF ekspresyonu

  42. SonuçveÖneriler • Sorumluluk tamamen klinisyenlere bırakılamaz; • Sorumluluk büyük oranda laboratuvaruzmanınaaittir; • Laboratuvar uzmanı, klinisyenleri doğru yönlendirmeli, • Sürekligelişimesasolmalı,

  43. Klavuzlartakipedilmeliveuygulanmalı, • Literatür takipedilmeli, • Kalitekontrolsistemleriuygulanmalı, • Preanalitikhatalaryanlışteşhis, tedaviveöngörüye yol açar, • Sonuçta hastanın yaşam kalitesiniolumsuzetkiler, • Biospesmenbilimi’ninvarlıgınıkabuletmeliyiz

  44. Teşekkürler

  45. Kılavuzlar (CLSI)

More Related