GAS CROMATOGRAFIA

1. GAS CROMATOGRAFIA

2. In gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All’uscita della colonna è posto il rivelatore che fornisce il gascromatogramma La GC nasce da una idea di Martin e Synge (1941) (premio Nobel nel 1952) e poi sviluppata da James e Martin (1952) Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge

3. …The method of Martin and Synge, in different forms, has already found extensive application in all branches of chemistry and important discoveries have been made with it. New and interesting substances have been traced and isolated with its help. Metabolic pathways in the organism can be studied and formerly unknown intermediary products identified. This has been done, for example, with studies of the way in which the green leaves of plants build up starch out of the carbon dioxide of the air. With Martin and Synge's method, Calvin and his co-workers in Berkeley have been able to identify some of the most important links in this process, perhaps the most important chemical reaction on our planet… Prof. Tiselius, presentazione al Nobel, 1952

4. In GC è fondamentale che gli analiti possano essere vaporizzati per via termica e a pressione ambiente (principale limite GC) • I componenti della miscela una volta vaporizzati sono separati in seguito alla ripartizione tra una fase gassosa mobile e una fase stazionaria • La fase mobile non interagisce con l’analita. La sua solo funzione è di carrier. • La separazione dipende quindi dalle caratteristiche chimico-fisiche della fase stazionaria e dalla temperatura

7. Classificazione delle tecniche gascromatografiche I criterio (stato fisico fase stazionaria) GC Gas solido Gas liquido II criterio (caratteristiche geometriche colonna ) GC Colonne impaccate Colonne capillari

8. Colonne impaccate: la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido deposto su un supporto costituito da particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo di acciaio o vetro di lunghezza da 1 a 6 metri con diametro interno di 0.75-4 mm. riempimento ID 0.75-4 mm

9. Colonne capillari: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1 - 5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro 0.1-0.75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria

11. Le prestazioni di una separazione GC vengono valutate in base a: • selettività: in GC dipende solo dalla fase stazionaria e dalla sua temperatura. Non esistono differenze tra colonne impaccate e capillari • efficienza: Notevoli differenze tra colonne impaccate e capillari: colonne impaccate N 4000, colonne capillari N range 50000-150000. (la permeabilità è nettamente superiore nelle colonne capillari e questo permette di raggiungere lunghezze fino anche a 150 m). • Per aumentare l’efficienza si può agire sulle seguenti variabili: • 1. Lunghezza colonna • 2. Diametro delle particelle (per colonne impaccate) • 3. Liquido di ripartizione: altamente selettivo per l’analita e poco viscoso • 4. diametro interno della colonna (sia per colonne impaccate sia per quelle capillari) • Risoluzione: dato N, è solitamente maggiore per le colonne capillari rispetto a quelle impaccate • Asimmetria picchi

12. Fase Mobile: Il gas Carrier • Il gas carrier deve avere le seguenti caratteristiche: • elevata inerzia chimica verso gli analiti e la fase stazionaria (gas nobili e azoto) • elevato grado di purezza. In particolare devono essere assenti umidità (disattivazione fase stazionaria), ossigeno (ossidazione fase stazionaria) e idrocarburi (aumento linea base) • Compatibilità con il rivelatore • I gas di trasporto più usati sono: • idrogeno • elio e miscele elio/idrogeno • azoto • argon • Diossido di carbonio

13. La fonte del gas di trasporto può essere rappresentato da bombole di acciaio dotate di riduttore di pressione (un secondo riduttore di pressione è presente nella GC) In alternativa si possono utilizzare dei generatori di gas (per azoto e idrogeno)

14. Fasi stazionarie per GC Fasi stazionarie solide (di uso limitato rispetto alle fasi liquide): Il meccanismo di separazione è per adsorbimento (la separazione dipende dalla forza di legame tra le molecole di analita e i siti attivi della fase stazionaria). Si utilizza tale tecnica per separare gas che non ripartiscono nella fase liquida (azoto, ossigeno, monossido di carbonio) e molecole organiche e in genere composti bassobollenti (metanolo, etanolo, acqua). I materiali più usati come fase stazionaria sono: Gel di silice Allumina Carbone attivo (mediamente polare) Zeoliti (silicati di alluminio e sodio)

15. Fasi stazionarie liquide:In tale tecnica le molecole di analita si sciolgono nella fase stazionaria liquida. Si ha quindi una ripartizione dell’analita tra la fase fissa (liquido) e la fase gassosa. • Nelle colonne impaccate e nelle SCOT, la fase liquida è ancorata su un supporto inerte che deve avere le seguenti caratteristiche: • Inerzia chimica • Resistenza meccanica e termica • Buon grado di bagnabilità da parte del liquido di ripartizione • Bassa resistenza al flusso di gas • Disponibilità sotto forma di particelle sferiche • I materiali più usati sono • Terra di diatomee (scheletri di piante unicellulari): materiale molto poroso con un buon grado di assorbività (fino al 30% del suo peso). I numerosi gruppi idrossilici vengono rimossi per silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS) • Teflon: poco adsorbenti • Vetro: poco adsorbenti

16. Silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS)

17. Nelle colonne WCOT, la fase stazionaria viene depositata sulle superficie interna della colonna di vetro o di silice fusa • Liquidi di ripartizione: • Il liquido di ripartizione da depositare sul supporto solido deve soddisfare numerosi requisiti tra cui: • Bassa tensione di vapore (per minimizzare la perdita di liquido durante le analisi) (la tensione di vapore aumenta esponenzialmente all’aumentare della temperatura) • elevata stabilità termica • Elevata inerzia chimica • Buon effetto solvente sulla miscela • Bassa viscosità per diminuire la resistenza al trasferimento di massa • Sulla base della polarità i liquidi di ripartizione si possono suddividere nelle seguenti classi: • prima classe: apolari (idrocaarburi o siliconi con sostituenti non polari) • seconda classe a bassa polarità quali derivati siliconici (polisilossani) con sostituenti polari • terza classe: polari (poliglicoli, polialcol e loro esteri) • Quarta classe: molto polari (glicoli, glicerina, idrossiacidi)

19. Polarità soluti Regola per la scelta della fase stazionaria: la scelta si basa sulla regola “il simile sciogli il simile” . es. le colonne apolari sono le migliori per i soluti apolari ecc.

20. Componenti olio di menta Colonna apolare (escono in base al loro punto di ebollizzione) Colonna polare (Carbovax) (trattiene fortemente i soluti polari)

21. Fasi stazionarie legate: La fase stazionaria liquida, trascinata dal gas di trasporto, si impoverisce inevitabilmente con il passare del tempo (bleeding). Questo fenomeno comporta l’aumento del disturbo del segnale di fondo (ad elevate temperature) (deriva) Per ovviare tale problema si lega chimicamente la fase ai gruppi idrossilici della silice di supporto o alle pareti della colonna  fase stazionaria legata. Queste trattamento permette inoltre il lavaggio con solvente delle colonne contaminate

22. Sistema di iniezione del campione Il campione viene iniettato (mediante opportuna siringa) attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna La camera viene generalmente riscaldata circa 50°C oltre il p.e. del componente meno volatile. Per le colonne impaccate il volume del campione varia da 0.1 a 20 µl. Per le colonne capillari la portata è notevolmente inferiore (almeno un fattore di 100) e richiedono un sistema di ripartizione

23. Iniezione frazionata (split) Le colonne capillari hanno una bassa portata: è quindi necessario che solo una frazione del campione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una parte del campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamento da 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0.1% del campione

24. Iniezione non frazionata (splitless) del campione Per campioni diluiti (gli analiti costituiscono meno dello 0.01% del campione) si utilizza la iniezione non frazionata (splitless)

25. Sistema di termostatazione della colonna La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la colonna è alloggiata in forni termostatati. L’analisi GC può essere effettuata a T costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau. Temperatura Tempo

26. Isoterma (45°C) Isoterma (145°C) Gradiente (da 30 a 180°C)

29. Rivelatori • I rivelatori sono dispositivi posti in uscita alla colonna che consentono di individuare i componenti di una miscela. Si distinguono in rivelatori universali e selettivi, quest’ultimi consentono di individuare solo particolari categorie di composti. • Il rivelatore ideale ha le seguenti caratteristiche: • adeguata sensibilità • buona stabilità e riproducibilità • risposta lineare in un intervallo di parecchi ordini di grandezza • tempo di risposta breve

30. Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID): E’ ampiamente utilizzato e di tipo universale. L’effluente della colonna viene direzionato in una fiamma aria/idrogeno. La maggior parte dei composti organici quando pirolizzati in tale fiamma producono ioni ed elettronii che generano una corrente elettrica (segnale) Vantaggi: buona sensibilità, range dinamico, robusto Svantaggi: metodo distruttivo; non sensibile a composti non idrocarburici come ad es. N2, O2, CO2, NH3 anodo catodo

31. Rivelatori a conducibilità termica (TCD): Rivelatore “storico” e ancora adesso diffuso. E’ un esempio di rivelatore robusto e universale. Il rivelatore dipende da un elemento riscaldato elettricamente (filamento di tungsteno o platino), la cui temperatura dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda. He e H2 buona conducibilità termica. La presenza di analiti (organici e inorganici) riduce la conducibilità termica del gas con conseguente  temperatura filamento (segnale) Vantaggi: detector semplice e robusto, universale, range dinamico Svantaggi: bassa sensibilità

32. Rivelatori a cattura di elettroni (ECD): • Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni. • Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni ) emessi da una lamina contenente 63Ni radioattivo. • La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N2) genera un flusso di elettroni attratti dall’anodo (corrente stazionaria). • Quando le molecole dell’analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi

33. Derivatizzazione in GC • La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l’analisi GC • La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: • - aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) • - riduzione volatilità (permette l’analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) • - aumenta la stabilità • - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD) • Le principali reazioni di derivatizzazione sono: • Silanizzazione • Alchilazione • acilazione

34. Derivatizzazione mediante silanizzazione • La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. • In tale reazione l’H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico mediante una reazione di attacco nucleofilo (SN2; la reazione è guidata dal gruppo uscente) • L’agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH3)3-Si-Cl (TMS-Cl). -OH -SH -COOH -NH2 -NH CONH2 -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS)2 -NTMS CONHTMS TMS-Cl • La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione il seguente: • Alcoli (primario> secondario>terziario) > fenolo > carbossile > ammina> ammide

35. Dato che i reattivi reagiscono con H2O, è necessario usare solventi anidri (la piridina è il solvente più utilizzato) • Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOVAX) non sono compatibili con questi derivatizzanti • principali agenti silalizzanti (CH3)3-Si-Cl (TMS-Cl). TMS-Cl TRIMETILCLOROSILANO (CH3)3Si-imidazolo TMSIM (trimetilsililimidazolo) NB selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH3)3-Si-O-C(CH3)=N-Si(CH3)3 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) (CH3)3-Si-N(C2H5)2 TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina)

36. Derivatizzazione mediante alchilazione La derivatizzazione mediante alchilazione riduce la polarità di molecole sostituendo idrogeni attivi con gruppi alchilici. La reazione si effettua con alogenuri alchilici o arilici, diazoalcani secondo le reazioni: R-NH2 + 2Cl-R’  R-NR’ + 2HCl R-COOH + CH2N2 RCOO-CH3 + N2 R-OR’ R-SR’ R-COOR’ R-NHR’ R-NR’2 R-COONR’2 R-OH R-SH R-COOH R-NH2 R-NH R-CONH2 Tra i principali agenti alchilanti: BF3 in MeOH, dialchilacetali, pentafluorobenzilbromuri

37. Derivatizzazione mediante acilazione • La reazione di acilazione riduce la polarità di gruppi amminici, idrossilici, tiolici e inserisce gruppi funzionali alogenati per ECD. • La reazione di acilazione si utilizza per composti altamente polari come carboidrati e amino acidi. • I reattivi utilizzati sono solitamente anidridi e alogenuri acilici • I principali agenti derivatizzanti sono anidridi fluorinate (anidride pentafluoropropionica e eptafluorobutirrica)

38. Anidride trifluoroacetica

41. Applicazione gas-cromatografia Analisi qualitativa Analisi quantitativa Conferma presenza/assenza di un composto in una data miscela (necessità dello std.)

42. Analisi quantitativa in gas-cromatografia • La gascromatografia è ampiamente usata per l’analisi quantitativa: l’altezza o l’area dei picchi è proporzionale con la quantità dei diversi componenti la miscela analizzata • Esistono diversi metodi di misura della concentrazione tra cui: • Normalizzazione interna: è il metodo usato per determinare la composizione percentuale quando tutti i componenti della miscela sono rappresentati nel cromatogramma • Metodo della standardizzazione esterna: consente di determinare la concentrazione di uno o più componenti utilizzando lo std. e allestendo la curva di calibrazione • Aggiunta singola o multipla

43. In GC si preferisce l’uso di uno std. interno che consente analisi quantitative più accurate: tale tecnica prevede l’aggiunta di una molecola alla miscela da analizzare in quantità nota. • Curva di calibrazione: l’asse delle y non fa riferimento all’area del picco dell’analita ma al rapporto tra l’area del picco dell’analita e quella dello std. interno • Lo std. interno deve soddisfare i seguenti requisiti: • Non essere presente nella miscela da analizzare • Essere ben risolto dagli altri componenti • Avere un TR simile a quello dell’analita • Avere una concentrazione simile a quella dell’analita • Non contenere impurezze • Non reagire con il campione

45. Applicazioni della GC in EU V ed. • Determinazione titolo • Identificazione e analisi quantitativa di droghe • Determinazione quantitativa e semiquantitativa di impurezze • Solventi residui • Pesticidi

46. CHOLESTEROL Cholesterolum C27H46O Mr 386.7 DEFINITION Cholesterol contains not less than 95.0 per cent of cholest-5-en-3β-ol and not less than 97.0 per cent and not more than 103.0 per cent of total sterols, calculated with reference to the dried substance. ASSAY Examine by gas chromatography (2.2.28), using pregnenolone isobutyrate CRS as the internal standard. Internal standard solution. Dissolve 0.100 g of pregnenolone isobutyrate CRS in heptane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution. Reference solution. Dissolve 25.0 mg of cholesterol CRS in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution.

47. The chromatographic procedure may be carried out using: —  a fused-silica column 30 m long and 0.25 mm in internal diameter coated with poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm), —  helium for chromatography R as the carrier gas with a split ratio of 1:25 at a flow rate of 2 ml/min, —  a flame-ionisation detector, maintaining the temperature of the column at 275 °C, that of the injection port at 285 °C and that of the detector at 300 °C. Inject 1.0 µl of each solution. The assay is not valid unless the resolution between the peaks due to pregnenolone isobutyrate and cholest-5-en-3β-ol in the chromatogram obtained with the reference solution is at least 10.0. Calculate the percentage content of cholest-5-en-3β-ol, using the declared content of cholest-5-en-3β-ol in cholesterol CRS. Calculate the percentage content of total sterols by adding together the contents of cholest-5-en-3β-ol and other substances with a retention time less than or equal to 1.5 times the retention time of cholest-5-en-3β-ol. Disregard the peaks due to the internal standard and the solvent.

48. RRR-α-TOCOPHEROL RRR-α-Tocopherolum C29H50O2 Mr 430.7 DEFINITION (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-ol. Content: 94.5 per cent to 102.0 per cent. Related substances. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Internal standard solution. Dissolve 1.0 g of squalane R in cyclohexane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. Test solution (a). Dissolve 0.100 g of the substance to be examined in 10.0 ml of the internal standard solution. Test solution (b). Dissolve 0.100 g of the substance to be examined in 10 ml of cyclohexane R. Reference solution (a). Dissolve 0.100 g of α-tocopherol CRS in 10.0 ml of the internal standard solution. Reference solution (b). Dissolve 10 mg of α-tocopherol R and 10 mg of α-tocopheryl acetate R in cyclohexane R and dilute to 100.0 ml with the same solvent.

49. Column: — material: fused silica; — size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm; — stationary phase: poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1 ml/min. Split ratio: 1:100. Temperature: Detection: flame ionisation. Injection: 1 µl of test solution (b) and reference solution (b). System suitability: reference solution (b): —  resolution: minimum 3.5 between the peaks due to α-tocopherol and α-tocopheryl acetate. Limits: —  total: maximum 4.0 per cent;

50. STAR ANISE OIL OIL Anisi stellati aetheroleum DEFINITION Essential oil obtained by steam distillation from the dry ripe fruits of Illicium verum Hook. fil. Chromatographic profile. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Test solution. Dissolve 200 µl of the substance to be examined in 1.0 ml of hexane R. Reference solution. To 1.0 ml of hexane R, add 20 µl of linalol R, 20 µl of estragole R, 20 µl of α-terpineol R, 60 µl of anethole R and 30 µl of anisaldehyde R. Column: — material: fused silica, — size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm, — stationary phase: macrogol 20 000 R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1.0 ml/min. Split ratio: 1:100. Detection: flame ionisation. Injection: 0.2 µl.