CROMATOGRAFIA Histórico

éter de petróleo mistura de pigmentos CaCO3 pigmentos separados CROMATOGRAFIA Histórico M. TSWEET (1903): Separación de diferentes pigmentos vegetales en columnas rellenadas con adsorventes sólidos y solventes variados. Cromatografia = kroma [color] + graph [escribir] (griego)

CROMATOGRAFIA Modalidades y Clasificación Cromatografia Líquida FM = Líquido Cromatografia Gasosa (CG) FM = Gas Cromatografia Gas-Sólido (CGS) Sólida En CG a FE puede ser: Cromatografia Gas-Líquido (CGL) Líquida

1 6 2 4 5 3 Cromatógrafo Gaseoso 1 - Reservorio de Gas y Controles de Vapor / Presión. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Columna Cromatográfica. 4 - Detector. 5 – Amplificador de Señal. 6 - Registro de Señal (Registrador con Computadora). Observación: en rojo: temperatura controlada

oxida / hidroliza algunas FE incompatibles con el DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído sin señal del DIC INSTRUMENTACIÓN Gas de Arraste Fase Móvil en CG: NO interacciona con la muestra - apenas se desliza a través de la columna. Siendo usualmente referida como GAS DE ARRASTE Requisitos: INERTE No debe reaccionar con la muestra, fase estacionaria o superfícies del instrumento. PURO Debe ser exento de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria. Impurezas típicas en gases y sus efectos:

A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) C COSTO B A PUREZA DCT He , H2 DIC N2 , H2 DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4 INSTRUMENTACIÓN Gas de Arraste Requisitos: COSTO Gases de altísima pureza pueden ser muy caros. COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada detector demanda um gas de arraste específico para mejor funcionamiento. Selección de Gases de Arraste en Función del Detector:

Componentes necesarios en la linea de gas: controladores de vapor / presión de gas dispositivos para purificación de gas (“traps”) 3 6 4 2 1 5 INSTRUMENTACIÓN Alimentación del Gas de Arraste 1 - Cilindro de Gas 2 - Regulador de Presión Primario 3 - “Traps” para eliminar impurezas del gas 4 - Regulador de Presión Secundario 5 - Regulador de Vapor (Controlador Diferencial de Flujo) 6 - Medidor de Vapor (Rotametro) Nota: Tubos y Conecciones: Acero Inox o Cobre

1 2 3 4 INSTRUMENTACIÓN Inyector “en-columna” Convencional 1 - Septo (silicona) 2 - Alimentación de gas de arraste 3 - Bloque metálico caliente 4 - Punta de columna cromatográfica

1 3 2 INSTRUMENTACIÓN Inyección “en-columna” de líquidos 1 - Punta de aguja de microjeringa introducida al inicio de la coluna. 2 – La muestra inyectada y vaporizada instantaneamente al inicio de la columna. 3 - “Plug” de vapor de mustra forzado para gas de arraste a fluir por la columna.

muestras Líquidas muestras Gasosas Columna empaq.  = 3,2 mm (1/4”) 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL capilar  = 0,25 mm 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL INSTRUMENTACIÓN Parametros de Inyección TEMPERATURA DE INYECTOR Debe ser sufi-cientemente elevada para que la muestra se vaporice imediatamente, sin descomposición Regla Gral:Tinj = 50oC encima de la temperatura de ebulición del componente menos volátil VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra Sólidos: convencionalmente se disuelve en un solvente adecuado y se inyecta la solución

Microjeringa de 10  L: aguja (inox 316) êmbolo cuerpo (pirex) Microjeringa de 1  L (sección ampliada): cuerpo aguja guia embolo INSTRUMENTACIÓN Microjeringas para Inyección LÍQUIDOSCapacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L

INSTRUMENTACIÓN Colmunas: Definiciones Básicas EMPAQUETADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Relleada con sólido pul-verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas de relleno) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recubier-tas con un film fino (fracción de m) de FE líquido o sólido

INSTRUMENTACIÓN Temperatura de la Columna TEMPERATURA DE LA COLUMNA CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER BUENA SEPARACIÓN EN CG

FÁCIL ACESSO À COLUNAA operação de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDOImportante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C. INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente operado por microprocessadores.

TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos volá-teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais volá-teis não são separados - Componentes menos volá-teis eluem mais rapidamente INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:

Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TINITemperatura Inicial TFIM TFIMTemperatura Final R TEMPERATURA tINITempo Isotérmico Inicial TINI tFIMTempo Final do Programa tFIM tINI RVelocidade de Aquecimento TEMPO INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Parâmetros de uma programação de temperatura:

viscosidade vazão INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTEA viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASEDevido ao aumento de volatilização de FE líquida

INSTRUMENTAÇÃO Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas-sagem de substâncias que não o gás de arraste Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID)Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD)Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. ANALÓGICO Registradores XY REGISTRO DE SINAL DIGITAL Integradores Computadores INSTRUMENTAÇÃO Detectores Mais Importantes:

FE líquida SUPORTE Sólido inerte poroso Tubo capilar de material inerte Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são “presas” ao suporte por ligações químicas FASES ESTACIONÁRIAS Conceitos Gerais LÍQUIDOSDepositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares) Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é: SÓLIDOSColunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar)

SELETIVADeve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USOMaior flexibilidade na otimização da separação. BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICAMaior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra POUCO VISCOSAColunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases) DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZAColunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas. FASES ESTACIONÁRIAS Características de uma FE ideal

Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) Solutos polares ADSORÇÃO Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...) FASES ESTACIONÁRIAS FE Sólidas: Adsorção O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é aADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

aço inox MATERIAL DO TUBO ø = 3 mm a 6 mm vidro pirex níquel L = 0,5 m a 5 m TEFLON dp MESH 177 - 250 mm 60 - 80 mesh Granulometria do recheio 149 - 177 mm 80 - 100 mesh 125 - 149 mm 100 - 120 mesh - Diminuição de dC Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste - Diminuição de dp - Recheio regular COLUNAS EMPACOTADAS Definições Básicas Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra-nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido. Eficiência maximizada com:

área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1 A FE líquida deve ser disposta sobre um SUPORTEsólido microporos regulares (~ 1 mm) NÃO interagir com a amostra boa resistência mecânica Esqueletos fósseis (SiO2 + óxidos metálicos) de algas microscópicas Chromosorb Anachrom Supelcoport ... COLUNAS EMPACOTADAS FE Líquidas: Suporte Uso quase universal:TERRA DIATOMÁCEA secagem calcinação fusão com soda lavagem com ácido silanização

Valores comuns: 0,25 mm 0,10 mm 0,53 mm 0,32 mm 1 3 2 Colunas de altíssima eficiência (amostras complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra 1 Diâmetros mais comuns; capacidade volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção 2 Colunas “megabore”: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite uso de injetores convencionais 3 COLUNAS CAPILARES Diâmetro Interno  dC =  Eficiência

Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro) Injeção direta com microseringa muito difícil !!! 1 2 1 - Septo; 2 - Entrada de gás de arraste; 3 - “Liner” (misturador); 4 - Coluna Capilar 5 - Purga de gás de arraste; 6 - Válvula de controle de purga. 3 5 4 6 COLUNAS CAPILARES Colunas Capilares: Injeção Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada - Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada) - Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor) - Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros

COLUNAS CAPILARES Large Volume Injection (LVI) Combinando injetores com temperatura programada, vál-vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 m L) de amostra 1Colunas e injetor frios; válvula de purga aberta (solvente é eliminado) 2Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga fechada (constituintes de interesse transferidos para coluna analítica)

“Feixes” paralelos de colunas capilares com dC convencional Separação de explosivos em coluna multicapilar (OV-17, 1000 capilares x 6 m) 1 - 2,6-DNT 2 - 2,4-DNT 3 - 2,4,6-TNT 4 - 3,4,5-TNT 5 - 2,3,4-TNT 6 - RDX ? 7 - tetryl COLUNAS CAPILARES Colunas Multicapilares - Eficiência próxima à das colunas convencionais - Capacidade similar à das colunas empacotadas - Colunas mais curtas: análises mais rápidas

S = 3 N SINAL (S) RUÍDO (N) Contaminantes nos gases Fontes de Ruído Impurezas acumuladas no detector Aterramento elétrico deficiente DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVELMassa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído RUÍDOQualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra

O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica. Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica DETECTORES Detector por Ionização em Chama PRINCÍPIOFormação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio

COLETOR AR FLAME TIP H2 BLOCO COLUNA DETECTORES Detector por Ionização em Chama Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma corrente elétrica: O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam:

Incandescência Estrutura da chama três regiões básicas Reação Quebra CH + O  CHO+ + e- Queima de substâncias com ligações C-H 1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados Formam-se apenas radicais !!! Queima de H2 DETECTORES Detector por Ionização em Chama Química da Chama de Hidrogênio: Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos. Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito). Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).

BIBLIOGRAFIA • http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/GC.doc • http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/cgced_1.htm

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