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Cromatografia Generale

Cromatografia Generale. Un sistema cromatografico…. Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : Una fase STAZIONARIA Una fase MOBILE L’analita (o una miscela di analiti). Cromatografia. Analisi antidoping e degli stupefacenti Metabolismo di xenobiotici e farmaci

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Presentation Transcript

  1. Cromatografia Generale

  2. Un sistema cromatografico… • Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : • Una fase STAZIONARIA • Una fase MOBILE • L’analita (o una miscela di analiti)

  3. Cromatografia Analisi antidoping e degli stupefacenti Metabolismo di xenobiotici e farmaci Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua) Analisi DNA, purificazione proteine Analisi degli alimenti Analisi dei profumi e dei cosmetici etc etc.

  4. CROMATOGRAFIA La CROMATOGRAFIA interessa la separazione di miscele liquide complesse. La separazione avviene grazie alle differenze nei coefficienti di distribuzione (equilibrio di distribuzione) delle specie chimiche presenti nel campione tra 2 FASI differenti.Una di queste fasi è la fase mobile e l’altra è la fase stazionaria. - Stesso principio dell’estrazione con solvente !!!

  5. Coefficiente di distribuzione (Equilibrio di distribuzione ) Definizione: La diversa affinità di 2 componenti la miscela verso la fase stazionaria determina la separazione cromatografica Concentrazione del componente A nella fase stazionaria Concentrazione del componente A nella fase mobile Amobile Astazionaria K distr = K distr

  6. Tipi di Cromatografia 1. Cromatografia Liquida su Colonna  (HPLC) 2. Gas Cromatografia  (GC) • Cromatografia su strato sottile (TLC)

  7. Processo Cromatografico

  8. Sistemi Cromatografici

  9. Tecniche Cromatografiche TLC/PC PC-Paper Chrom HPLC GC/SFC

  10. Cromatografia – Meccanismo separazione • Adsorbimento • Partizione • Scambio Ionico – Interazione ionica • Esclusione dimensionale • Affinità (interazione anticorpo-antigene; interazione chimica; attrazione) • Complessazione - Chelazione

  11. Problemi di assorbimento!!!!! ASsorbimento ADsorbimento Diversi tipi di assorbimento

  12. Cromatografia – Meccanismo di Separazione Partizione Scambio ionico Adsorbimento

  13. Cromatografia – Meccanismo di Separazione Affinità Esclusione dimensionale

  14. Cromatogramma – Parametri di base tR = Tempo di ritenzione tm = Tempo morto H W1/2 1/2H Picco non trattenuto

  15. Teoria Cromatografica • Tempo di ritenzione : tR’ = tR – tM • Teoria dei piatti – distillazione – numero di piatti N = 5.54[(tR – tM)/w1/2]2 • Altezza dei piatti H = L/N • Questa teoria non tiene conto della interazione degli analiti con la fase stazionaria

  16. Cromatografia – Allargamento dei picchi

  17. Cromatografia - Teoria • Teoria delle velocità – fattori cinetici – van Deemter H = B/u + Cu (+ A) Dove: u – velocità della fase mobile B – effetto della diffusione molecolare C – resistenza al trasferimento di massa A – allargamento dovuto alla diversa distanza percorsa dalle molecole nelle colonne impaccate

  18. Cromatografia – Effetto dell’impaccamento sull’allargamento dei picchi

  19. Parametri di van Deemter (B) : Diffusione Molecolare (B)– nella fase mobile: • proporzionale al tempo che l’analita passa nella colonna • influenzato dal coefficiente di diffusione dell’analita nella fase mobile • influenzato dalla temperatura e pressione • poco importante in LC – basso coefficiente di diffusione • inversamente proporzionale alla velocità della fase mobile

  20. Parametri van Deemter (C): Resistenza al trasferimento di massa (C): • trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e mobile • mancanza di equilibrio – fase mobile • influenzata dallo spessore della fase liquida • inversamente influenzata dal diamentro delle particelle o dal diametro interno della colonna capillare • diminuisce all’aumentare della temperatura (viscosità)

  21. Parametri van Deemter: Conclusioni: • Il più basso valore di H si ottiene quando: • lo spessore della fase stazionaria è minimo • la colonna è impaccata con particelle molto fini • le colonne capillari hanno il diametro più piccolo • la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa viscosità e elevato coefficiente di diffusione

  22. Cromatografia – van Deemter Altezza dei piatti (cm) H Cu Trasferimento di massa Effettomultipercorso A Diffusione (Longitudinale) B/u Velocità fase mobile

  23. Cromatografia - Risoluzione DtR tR1 tR2 R = 2(tR1 – tR2)/Wb1 – Wb2 Response 100% Baseline resolution for Gaussian shape peaks = 1.5 Wb1 Wb2

  24. Cromatografia - Risoluzione • Equazione per il parametro di risoluzione Rs = ½ x (a-1/a+1) x k’2/1+k’2x (L/h)1/2 Dove: a – fattore di selettività (separazione) a = tR1/tR2 k’ – termine di migrazione, fattore di capacità; k’ = ms/mm L – lunghezza della colonna h – altezezza piatto

  25. Chromatography - Resolution

  26. Cromatografia • Analisi Qualitativa • Retention data – RT; Rf; RRT; Kovacs Index • Analisi Quantitativa • Peak ar ea and height usually proportional to the amount of component • Calibration • Internal Standard method • External Standard method • Area Normalization method

  27. Chromatogram – Basic Parameter tR = retention time tm = dead time H W1/2 1/2H unretained

  28. THE END

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