1 / 22

GTPáz aktivitás mérése gyakorlat

GTPáz aktivitás mérése gyakorlat. Lévay Magdolna 2006.04.10. Rac. P. P. Rac - GDP. P. Rac - GDP. GAP. GDP. Módszer: GAP assay A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata. mosás. mosás. Módszer: GAP assay. GAP nélkül: lassú GTP-hidrolízis.

emerald-mcfadden
Download Presentation

GTPáz aktivitás mérése gyakorlat

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. GTPáz aktivitás mérése gyakorlat Lévay Magdolna 2006.04.10.

  2. Rac P P Rac- GDP P Rac- GDP GAP GDP Módszer: GAP assayA kis GTPázok aktivitásának vizsgálata

  3. mosás mosás Módszer: GAP assay GAP nélkül:lassú GTP-hidrolízis GAP jelenlétében: gyors GTP-hidrolízis Beütésszám pl. 82800 Beütésszám pl. 8468

  4. A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata I.: Időbeli kinetika -mérés egy GAP koncentráció mellett különböző időpontokban (pl. 0,5, 10, 15 perc) Fehérjéhez kötött 32P-GTP(%) Idő (min)

  5. A kis GTPázok aktivitásának vizsgálata II.: Koncentrációfüggés -mérés egy adott időpontban (pl. 5. perc) kötött 32P-GTP(%) A GAP relatív mennyisége

  6. P P Rac- GDP Rac P GDP GAP 1.a: Rac + [32P]GTP → inkubálás alacsony [Mg] mellett (10 min) → + 1μl 1 M MgCl2 (10 min, 4oC) → Assay buffer 2. Rac+ GAP Inkubálás → 100 μl oldat az indításhoz → 5 min inkubálás 3. A reakció leállítása → 150μl 4oC Wash Buffer → nitrocelluóz korongra → mosás 5 ml Wash Bufferrel Rac- GDP 1.b: GAP bemérése → Wash Buffer + GAP GAP Módszer: GAP assayA kis GTPázok aktivitásának vizsgálata

  7. Az oldatok összeállítása • Rac töltése: 86μl nucleotide depletion buffer* 10μl 10 mg/ml BSA (bovine serum albumin) 1μl 10 mM ATP 1μl 10 mM DTT 1μl Rac (1-2 μg) 1μl [32P]GTP izotóp (25 μl= 10 MBq) +1μl 1M MgCl2 • Assay buffer: 100μl 10 mg/ml BSA 10μl 10 mM ATP 10μl 10 mM DTT 2-8 ml→ 100 μl az indításhoz 10μl 10 mM GTP ad 1 ml Wash Buffer** 10 min inkubálás szobahőm. 10 min inkubálás 4oC

  8. Oldatok *nucleotide depletion buffer: 50 mM HEPES, pH 7.4 50 mM NaCl 0.1 mM DTT 0.1 mM EGTA 5mM EDTA **Wash Buffer: 25 mM HEPES, pH 7.5 50 mM NaCl 1 mM MgCl2 10 ml 1 l

  9. Beckman LS-5000TD Liquid SCINTILLATION COUNTER

  10. A mérés alapja: Cerenkov effektus

  11. Mire figyeljünk? • Pipettázás

  12. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva!

  13. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva! • Egy membránra egy mintát tegyünk

  14. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva! • Egy membránra egy mintát tegyünk • Membránok mosása

  15. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva! • Egy membránra egy mintát tegyünk • Membránok mosása • Minták sorrendje, számozás

  16. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva! • Egy membránra egy mintát tegyünk • Membránok mosása • Minták sorrendje, számozás • Ne zavarjuk meg az izotóp laborban dolgozó munkatársunkat

  17. Mire figyeljünk? • Pipettázás • Vákuum legyen bekapcsolva! • Egy membránra egy mintát tegyünk • Membránok mosása • Minták sorrendje, számozás • Ne zavarjuk meg az izotóp laborban dolgozó munkatársunkat • Sugárvédelem!

  18. Sugárvédelem Az izotópot mindig plexiüveg mögött nyissuk ki! Figyeljünk az izotópos hulladék elhelyezésére! Dokumentáció

  19. Sugárvédelem Lehetőleg plexiüveg mögött és kesztyűben dolgozzunk.

  20. Irodalom Settleman J, Albright CF, Foster LC, Weinberg Association between GTPase activators for Rho and Ras families.Nature. 1992 Sep 10;359(6391):153-4. Molnar G, Dagher MC, Geiszt M, Settleman J, Ligeti E. Role of prenylation in the interaction of Rho-family small GTPases with GTPase activating proteins.Biochemistry. 2001 Sep 4;40(35):10542-9. Ligeti E, Dagher MC, Hernandez SE, Koleske AJ, Settleman J. Phospholipids can switch the GTPase substrate preference of a GTPase-activating protein.J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):5055-8. Epub 2003 Dec 29. Moskwa P, Paclet MH, Dagher MC, Ligeti Autoinhibition of p50 Rho GTPase-activating protein (GAP) is released by prenylated small GTPases.J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6716-20. Epub 2004 Dec 13.

More Related