Transpozibilní elementy

1. Transpozibilní elementy

2. Transpozóny • = mobilní genetické elementy • úseky DNA schopné přenosu na jiné (další) místo genomu (transpozice) • U Prokaryot i všech dosud analyzovaných Eukaryot • (s výjimkou parazita Plasmodium falciparum) • - u rostlin tisíce rodin (až 80% genomu) • - živočichové 3-45%, houby 2-20%

3. Typy transpozónů • “DNA transpozóny” kódují transpozázu, která zajišťuje vyštěpení a přenos transpozónu do jiného místa genomu „CUT and PASTE“ (ale některé i „COPY and PASTE“ - rolling circle replication!) • “Retrotranspozóny” kódují reverzní transkriptázu, která z RNA transkriptů vytváří DNA kopie, které se pomocí integrázy začleňují do různých míst genomu „COPY and PASTE“

4. Ne všechny transpozóny kódují potřebné enzymatické aktivity • Autonomní elementy – kódují gen, jehož produkt zajistí přenos/replikaci • Neautonomní elementy – odvozené od autonomních – ztratily geny potřebné pro přenos, ale mohou být mobilizovány jinými (příbuznými) autonomními elementy – mají sekvence potřebné k mobilizaci (!)

5. Objevení transpozónů Barbara McClintock (1902-1992) Nobelova cena za Fyziologii and Medicínu 1983 za objevení (poznání podstaty) mobilních genetických elementů kukuřice 1940-1950

6. Objevení transpozónů(B. McClintock) • studium chromozomálních zlomů u kukuřice • zvýšený výskyt zlomů v určité oblasti • (= marker nazvaný „dissociation“ Ds) • poloha markeru ale nebyla po křížení s některými liniemi stabilní, a přesouvala se na jiná místa (= linie nesoucí „activator“ Ac)

7. u jedné linie způsobil přesun Ds markeru ztrátu purpurového zbarvení obilek • světlá barva obilek (c) způsobená inzercí Ds elementu však nebyla při křížení s liniemi nesoucími Ac stabilním znakem - objevovaly se obilky s červenými skvrnami • c/c/c = světlé obilky • C/c/c nebo C/C/cnebo C/C/C = purpurové zbarvení • triploidní endosperm

8. Transpozice a zbarvení obilek • pokud dojde k reverzi c na C, začne se v buňce tvořit červený pigment a vytvoří se skvrna na světlém pozadí, čím dříve ve vývoji obilky dojde k reverzi, tím je skvrna větší • B. McClintock vyvodila, že “c” alela vznikla začleněním neautonomního transpozónu “Ds” do “C” alely (Ds = dissociation) • reverze c na C je způsobena transpozicí Ds elementu z c alely, která je zprostředkována autonomním transpozonem “Ac” • (Ac = activator) PROČ tak vysoká frekvence?

9. Barbara McClintock (1902-1992) 1951: formulovala základní koncept epigenetiky "[T]he progeny of two (such) sister cells are not alike with respect to the types of gene alteration that will occur. Differential mitoses also produce the alterations that allow particular genes to be reactive. Other genes, although present, may remain inactive. This inactivity or suppression is considered to occur because the genes are ‘covered' by other nongenic chromatin materials. Gene activity may be possible only when a physical change in this covering material allows the reactive components of the gene to be ‘exposed' and thus capable of functioning."

10. Klasifikace transpozónů • Třídy: Dle toho, zda je či není intermediátem při replikaci RNA • DNA transpozóny • Retrotranspozóny • Podtřídy: Dle mechanismu replikace (u DNA transpozómů) • Řády: Dle základních strukturních rysů • Nadčeledi: Dle sekvenční příbuznosti Nature Rev. Genet. 2008

11. Základní typy TE dle transpozice Lisch 2013, Nature Rev. Genet.

12. Třída II: DNA transpozóny

13. DNA transpozóny - podtřída I: • zpravidla kódují transpozázu, na okrajích jsou invertované repetice • (pozn.: houbový řád Crypton nemá transpozázu, ale rekombinázu) • - složitý proces transpozice – vazba IR, štěpení (transpozáza), štěpení cílové sekvence, syntéza DNA, ligace • - zdvojení krátké sekvence (2-8 bp) v místě začlenění = footprint po opětovném vyštěpení Množení DNA transpozónů?

14. Přesuny a množení DNA transpozónů Mechanismus aktivace při replikaci? Hemimetylovaný stav? + opravy zlomu po vyštěpení TE podle homologního úseku (tedy možnost znovuzačlenění vyštěpené TE sekvence)

15. DNA transpozóny - podtřída I • - vyšší pravděpodobnost začlenění v blízkosti původní inserce - klastrování • většinou několik až několik set kopií v genomu • př.: - Ac, Spm, Mu (kukuřice), Tam (Antirrhinum), TphI (petunie), • TagI (Arabidopsis) • - MULE (Mutator-like elements) u rýže – mobilizováno přes 1000 genových fragmentů – 5% je exprimováno! – evoluce nových genů • - mutované neautonomní formy Ac/Ds (Ds1, Ds2), Spm/dSpm • Stowaway, Tourist >10 000 kopií, každých 30kbp u kukuřice • (inserce do TA bohatých sekvencí)

16. DNA transpozóny podtřída II: řád: Helitron – jednovláknový zlom a replikace - zřejmě mechanismem valivé kružnice - Rep/helikase-like, replication protein A-like - u kukuřice 4 až 10 tis. mobilizovaných gen.úseků řád: Mavericks - zřejmě vyštěpena ssDNA (poté mimochromozomální replikace a integrace)

17. Třída I: Retrotranspozóny

18. Retrotranspozóny • replikace přes RNA intermediát (četné potomstvo!) • velikost 1-13kbp, až milióny kopií (až 40-80% genomu) • často v heterochromatinových oblastech, v euchromatinu především mezi geny - zřejmě důsledek selekčního tlaku • Řád: LTR – nejvýznamnější TE u rostlin • - podobné retrovirům • LTR (long terminal repeat) - promotor, terminátor, přímá repetice • krátké zdvojení cílové sekvence • - nucleocapsid, proteáza, RT, RNáza H, integráza

19. Retrotranspozóny LTR - replikace - LTR (U3, R, U5) - PBS (primer binding site) tRNA primer - přeskoky mezi templáty (přímý repeat - R)

20. Příklady retrotranspozónů s LTR Ty1- copia group BARE-1, ječmen, 12,1 kbp, >50 000 kopií, transkript v listech a kalusu Opie –1, kukuřice, 8,7 kbp, >30 000 kopií, kořeny, listy, integrace do LTR PREM-2, kukuřice, 9,5 kbp, >10 000 kopií, mikrospory Tnt1, tabák, 5,3 kbp, >100, protoplasty, kořeny, po poranění, ataku patogenu, integrace do euchromatinu Ty3 – gypsy group potenciální předci živočišných retrovirů, někdy i env-like sekvence Athila, A.t., 10,5 kbp, >10000, paracentromerické oblasti Athila-1-1, A.t., 12 kbp, 730, env-like sekvence Cinful-1, kukuřice, 8,6 kbp, 20000, listy, env-like sek.

21. Retrotranspozóny bez LTR LINE (long interspersed nuclear elements) SINE (short interspersed nuclear elements) LINE - fylogeneticky zřejmě nejstarší, předchůdci transpozónů s LTR - 5´oblast – promotor; 3´oblast - terminátor Cin4, kukuřice, 1-6,8kbp, 50-100, různě zkrácené formy SINE - využívají aparát (RT) jiných transpozónů - odvozeny od produktů RNA polymerázy III (tRNA, 7SLRNA, (rRNA)) - < 500 nt APE – endonuklease, RH – RNase H LINE

22. Regulace aktivity transpozónů • regulace vlastními mechanismy i hostitelem (individuálně) • - většinou neaktivní – metylace (siRNA, RdDM) • - jedna z možných příčin vzniku metylace DNA • - „heterochromatinizace“ nutná i pro zachování integrity genomu (brání nelegitimnímu crossing-overu) • - aktivace může být vývojově ovlivněná • - nárůst metylace Spm a Muv průběhu vývoje listů, demetylace v časnýchfázích vývoje • - aktivace v centrální buňce zárodečného vaku a veget. jádře pylu • - aktivace může být ovlivněna vnějšími podmínkami: • - Tam1 u hledíku (1000x při 15°C) • - Reme1 u melounu – aktivace UV zářením • - Tnt1 u tabáku po poranění či infekci (do euchromatinu) • zřejmě PŘÍČINA, DŮSLEDEK i VEDLEJŠÍ EFEKT

23. Význam transpozónů • navozování mutací = zvyšování variability • modulace exprese (aktivace, represe, vývojová, stresová) • evoluce (genů, genomů) • velký význam při domestikaci - PROČ • u rostlin na TE chybí geny, které přímo zvyšují fitness (rezistence apod.) • zvýšení fitness náhodně navozenou mutací (př. při aktivaci stresovými podmínkami) – velmi nízká pravděpodobnost … • … ale přesto!

24. Ovlivnění genové exprese transpozóny - místo začlenění (různé preference: GC, AT, transkrib., AP,…) - charakter nesených regulačních sekvencí Cis/Promotor 5´UTR exon intron exon 3´UTR terminátor • modulace exprese (časově i místně) – promotor, enhancery • změny ve stabilitě transkriptu a postranskripčních úpravách (sestřih) - UTR,introny, terminátor • změna sekvence výsledného proteinu (vč. footprintů), předčasná terminace translace, vznik chimerických genů,… • - exony,introny

25. Regulace genové exprese transpozóny př. réva: inaktivace exprese TF VvmybA1 (regulace antokyanových genů) přítomností retrotranspozónu z rodiny Gypsy (Kobayashi et al. 2004, Science)

26. Regulace genové exprese transpozóny př. kukuřice – inaktivace genu CCT (odpověď na délku fotoperiody) inzercí CACTA-like elementu (DNA TE) do promotorové oblasti – rozšíření pěstování do mírného pásma (kvetení za dlouhého dne) př. blok větvení (TE enhancer  OE inhibitoru) (Yang et al. 2013, PNAS) př. pomeranč Ruby – myb TF (regulace antokyanových genů) aktivovaný inzercí TF - chladem indukovaná exprese (Butelli et al. 2012, Plant Cell)

27. Význam v evoluci genů • - inserční mutageneze (předčasná terminace), footprinty • možná účast v multiplikaci genů • - přímo či zprostředkovaně přes homologní rekombinaci • - výhodné mít genové rodiny s různou regulací, popř. záložní kopie genů • tvorba bezintronových kopií genů (reverzní transkripcí) • geny, původně transpozónového původu byly mnoha • eukaryotickými organismy „domestikovány“ pro nové funkce • (př. telomerázy, syncitin, ….) • mohou se podílet na tvorbě zcela nových genů – např. fúzí • přenášených fragmentů stávajících genů (helitrons, MULE)

28. Význam transpozónů • - ovlivňování celkové architektury genomu • - většina repetitivní DNA v genomech rostlin je tvořena transpozóny, popř. sekvencemi jimi mobilizovanými (až 80 % genomu) • - mohou způsobovat chromozomální přestavby • (vlastní transpozicí, homologní rekombinací)

29. Změny na úrovni genomu • Chromozómové přestavby • (zlomy, inverze, delece, • duplikace, translokace) • - změny vazbových skupin, • speciace • Zvětšování genomu („genomic obesity“) • příčiny- vlastní transpozice (štěpení DNA, integrace) • x homologní rekombinace (repetitivní sekvence) • základní mechanismus bránící zvětšování genomu (u 2n druhů bavlníku až 3 násobné rozdíly ve velikosti genomu díky aktivní rekombinaci; Hawkins 2009 PNAS)

30. R Ds Transpozónová mutageneze • především u Arabidopsis • DNA transpozóny z kukuřice: Ac/Ds, Spm/dSpm – nízká frekvence • dvoukomponentní systém R Ds Gen pro transpozázu (indukovatelná exprese) rostlina s neautonomním elementem v genu rezistence Selekce rezistentních rostlin = s transpozicí neautonomního elementu V další generaci selekce rostlin bez transpozázy Modifikace - vyštěpením aktivovaná exprese represoru transkripce genu pro transpozázu

31. Transpozónová mutageneze • možnost určení místa začlenění (např. TAIL PCR) • častá mutageneze přilehlých oblastí (20 % v 1Mb okolí) • reintrodukcí transpozázy je někdy možné mutaci revertovat