München, den 03. Mai 2008 Standardisierung der HbA1c Bestimmung - Theorie und Praxis Albrecht Pfäfflin Zentrallabor/Me

1. München, den 03. Mai 2008 Standardisierung der HbA1c Bestimmung - Theorie und Praxis Albrecht Pfäfflin Zentrallabor/Med.Klinik Abt. IV, Tübingen

2. Fallbeispiel • Patient wird am selben Tag in verschiedenen Laboratorien bzgl. HbA1c untersucht: Labor A: 7,3% Labor B: 7,7% Labor C: 8,5% • Therapie beibehalten oder intensivieren?

3. Ergebnisse Ringversuch 1/2003 des Referenzinstitut für Bioanalytik der DGKL

4. Plan • Einleitung • Methoden-Vergleichbarkeit • Möglichkeiten zur Standardisierung • Referenzmethode • Mittels Kalibration • Designated comparison method (DCM) • Probleme • Zusammenfassung

5. Plan • Einleitung

6. Definition HbA1c: stabiles Addukt von D-Glukose am N-terminalen Ende der ß-Kette des HbA0 =N-(1-deoxyfructosyl)haemoglobin

7. Rückblick: • Erstbeschreibung (1955) von Glykiertem Hämoglobin • Differente Methoden ergeben nicht-vergleichbare Werte • Durch einheitliche Kalibration: interlabor-Variations-Koeffizienten (VK) von 16% auf 9% gesenkt. • Trotzdem sind die Werte nicht ausreichend vergleichbar • 1994 Gründung des National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) • 2001: im Rahmen der NGSP-Aktivitäten: VK auf <5% gesenkt. Literatur: Kunkel 1955 Science ; Weykamp CC 1995 Clin Chem; Little 2001 Clin Chem

8. Warum ist HbA1c nicht einfach standardisierbar? • Analyt aufgrund physikalischer Eigenschaften charakterisiert • unspezifische Substanzen können diese Eigenschaften imitieren • Vergleichbarkeit innerhalb einer Methode gut • Vergleichbarkeit zwischen Methoden schlecht

9. Warum ist HbA1c nicht einfach standardisierbar? • alle müssten das wirklich wollen • Verantwortung des Laborleiters/der Laborleiterin, welchen Kalibrator er/sie verwendet. • ca. 70 verschiedene kommerzielle Methoden zur HbA1c-Messung

10. Plan • Methoden-Vergleichbarkeit

12. Webseite Instand: VK bei Ringversuchen

13. Rechenbeispiel: Variationskoeffizient (VK) von 7% • VK=(SD/MW)*100 SD=Standardabweichung MW= Mittelwert • Bei Zielwert HbA1c 10%: SD von 0,7% • „kritische Differenz“: 3 SD nicht sicher unterscheidbar: Werte zwischen 9,0 und 11,0 % nicht sicher unterscheiden • Fazit: der VK sollte möglichst klein sein; • 2% sind vorgeschlagen von EASD, ADA, IDF • Ziel: um Unterschiede von 0,5% sicher zu erkennen • Diese Präzision ist interlaboratorisch schwer erreichbar

14. Gesetzliche Vorgaben: Deutschland: Richtlinien der Bundesärztekammer Vom 24.08.2001 Weiterhin übergangsweise gültig bis 31.03.2010 Richtigkeit 8%, Unpräzision 6%, max. Abweich. Einzelwert/Ringversuch: 20% Vom 23.11.2007 Gültig seit 01.04.2008 Zulässiger quadratischer Mittelwert der Messabweichung (Streuung der Messwerte um den wahren Wert): 10% Max. Abweichung Ringversuch: 18%

15. Plan • Möglichkeiten zur Standardisierung • Referenzmethode • mittels Kalibration • Designated comparison method (DCM)

16. Referenzmethode für HbA1c Definition: • Von IFCC-Experten entworfene, geprüfte und publizierte Goldstandard-Methode zur Bestimmung von HbA1c

17. Referenzmethode für HbA1c Prinzip: Vorbereitung: EDTA-Blut wird mit NaCl-Lösung gewaschen und hämolysiert Dann: Mittels Endopeptidase Glu-C werden 6 Aminosäuren abgespalten Literatur: Jeppsson et al. (2002) Approved IFCC Reference Method for the measurement of HbA1c in Human Blood. CCLM 40(1)78-89

18. Referenzmethode für HbA1c ESI-MS ( =Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie): • Prinzip: Analyt wird ionisiert, verdampft und mittels Masse-Ladungsverhältnis analysiert Literatur: Kobold et al Clin Chem, 1997

19. Referenzmethode für HbA1c Probleme (I) der Referenzmethode: Die Werte sind ca 1,5% niedriger Literatur: Miedema 2004 Diabetologia

20. Referenzmethode für HbA1c Probleme (II) der Referenzmethode: Die Referenzmethode soll gar nicht in den Routinelabors angewendet werden (zu aufwändig)Unklar: ob diese exakte Analytik tatsächlich die prädiktive Aussage der alten DCCT/UKPDS-Messungen hatdie Methode gibt es seit 6 Jahren, aber in der Praxis hat sich nichts wesentliches geändert

21. Einheitliche Kalibrierung für HbA1c Prinzip: • Mittels einer Probe mit bekanntem Zielwert: sollen die verschiedenen Methoden abgeglichen werden • Japanese diabetes society (JDS): Kalibratoren wurden produziert und einheitlich verwendet. Methoden für die Produktion eines Referenzmaterials sind beschrieben. • Problem: Aufwendige Herstellung der Kalibratoren Literatur: Finke Clin Chem Lab Med 1998

22. Designated Comparison method Prinzip: • Mittels einer (willkürlichen) “Referenz”-methode werden Methodenvergleiche durchgeführt, dadurch können Regressionsgleichungen ermittelt werden, um die Werte ineinander umzurechnen. • Vorteil: bietet sich an, da der Analyt mit unterschiedlichen Methoden gemessen wird, und Referenzmaterialien unzureichend verfügbar sind.

23. Designated Comparison method Wesentliche praktische Anwendung: • NGSP seit 1994 • “Referenz”-methode: Biorex 70-Ionenaustauschchromatographie in speziellen Referenzlaboratorien durchgeführt. • Problem: die Methode ist unspezifisch

24. Designated Comparison method

25. Designated Comparison method Was macht das NGSP: • CPRL: zentrales Labor, produziert den Kalibrator und erfüllt harte QC-Richtlinien • PRL: primäre Referenzlaboratorien • SRL: sekundäre Referenzlaboratorien • Müssen jeweils in definierten Zeiten eine definierte Anzahl von Proben messen und dabei definierte QC-Kriterien erfüllen. • Herstellerzertifikation • Ringversuchswesen

26. Designated Comparison method Weitere praktische Anwendung: • Swedish standardization scheme • “Referenz”-methode: Mono S-HPLC • Problem: die Methode ist auch unspezifisch, deutlich überlegen gegenüber Biorex 70

27. Vergleich Referenzmethode vs. Designated Comparison method/einheitliche Kalibrierung Literatur: Hoelzel Clin Chem 2004

28. Plan • Probleme

29. Organisationsstrukturen • Klinisch-Chemische Vereinigungen: • IFCC, daraus Referenzmethoden-Entwicklung • AACC, daraus NGSP hervorgegangen • DGKL • Klinische Vereinigungen: • ADA • EASD • IDF • DDG

30. Literatur: Mosca et al. Clin Chem Lab Med, 2007 • IFCC-working-group HbA1c • Gegründet 1995 • Referenzmaterialien hergestellt 1998 • Entwicklung der Referenzmethode 2002 • Verschiedene Vergleichsstudien wurden durchgeführt • Sekundäres Referenzmaterial wurde hergestellt

31. Literatur: Consensus Committee, Diabetes Care, 30, 2007 • Aktuelles consensus-statement 2007: • ADA/EASD/IDF/IFCC • HbA1c-Werte weltweit einheitlich reportieren • IFCC-Referenzmethode ist Basis für Standardisierung • Soll als mmol/mol und % (NGSP) angegeben werden • Falls Studien dokumentieren: Umrechnung des HbA1c-Wertes in „mean blood glucose“

32. Harmonisierungsbestreben von verschiedenen Organisationen Es gibt zwischen den verschiedenen Organisationen einen Dialog: Die IFCC-Werte • Könnten zu unzureichender Behandlung führen (e.g. Hanas R., Diabetes care 2002) • Wesentliche Studien wurden nicht mit der Referenzmethode durchgeführt …die Referenzmethode ist Fortschritt, aber...

33. Problem: Referenzmaterial • Aufwendige Herstellung • mehrere Aufbereitungsschritte • komplexe Qualitätskontrolle • sonst nicht generell für verschiedene Methoden geeignet Literatur: Finke Clin Chem Lab Med 1998

34. Rückführbarkeit auf Referenzmethode/Referenzmaterial

35. Persistierende Probleme bei Standardisierung • Durch eine Standardisierung werden negative Einflüsse nicht eliminiert (Hb-Varianten, unspezifische Veränderungen z.B. Carbamylierung, weitere Glykierungsprodukte) • Werte werden nur heruntergerechnet. • Bessere Vergleichbarkeit so nur bedingt erreichbar.

36. Forderungen • Interlabor-Präzision 2% • Dokumentiert (Weycamp, Clin Chem 2008): Präzision innerhalb eines Netzwerks <0,9% möglich • RiLiBÄK bis 2010: 6% Unpräzision, 8% Unrichtigkeit Gegebenheiten

37. Plan • Zusammenfassung

38. Zusammenfassung • Es gibt eine Referenzmethode • aufwändig • verändert die Werte • Routinemässig nicht anwendbar • Standardisierung unter freiwilligen Bedingungen weltweit ist schwierig

39. Perspektive • Was setzt sich durch? • Von der analytischen Seite ist zu fordern, den Analyten so spezifisch und standardisiert wie möglich zu messen. • Von klinischer Seite sowenig wie möglich ändern • Praktische Empfehlung: bislang weiter möglichst im selben Labor messen

40. Danke für die Aufmerksamkeit Standardisierung ist Sisiphosarbeit