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Design von Scaffold Proteinen. U. Fiedler Klinik und Poliklinik für Urologie Technische Universität Dresden. Eigenschaften von Proteinen. Allgemein: Größe Ladung Hydrophobizität Stabilität Struktur. Speziell: strukturbildend katalytische Aktivität Bindungsaktivität.
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Design von Scaffold Proteinen U. Fiedler Klinik und Poliklinik für Urologie Technische Universität Dresden
Eigenschaften von Proteinen Allgemein: Größe Ladung Hydrophobizität Stabilität Struktur Speziell: strukturbildend katalytische Aktivität Bindungsaktivität
Einsatz von Proteinen mit spezi- fischen Bindungseigenschaften Diagnostik:Medizin Veterinärmedizin Therapie:Medizin Monitoring:Lebensmittelanalytik Umweltanalytik Reinigung: pharmazeutische Industrie biotechnologische Industrie Umweltbiotechnologie
Peptide als Bindemoleküle Probleme:intrinsische Flexibilität Ensemble unterschiedlicher Konformationen in Lösung schlechte Bioverfügbarkeit kurze Halbwertszeiten Reduzierung der Flankierung mit Cysteinen Flexibilität durch:Verbindung mit Proteindomänen (Scaffolds)
Scaffold-Proteine Anforderungen:bekannte 3d-Struktur konserviertes Strukturgerüst Toleranz von Insertionen bzw. Mutationen in lösungsmittelzugänglichen Bereichen geringe Größe hohe Stabilität Einsatz:Insertion von Peptidlibraries Insertion von Bindungsdomänen ortsspezifische Mutagenese in Sekundärstrukturbereichen
Antikörpermoleküle als Scaffolds Mutagenese: CDR1, CDR2, CDR 3 Scaffolds: VH-Domäne VL-Domäne
Loop-Peptidlibraries Scaffold Größe Mut. AS Target Autor Minibody 61 AS 6 + 6 IL-6Ra Martin et al. (1994, 1996) Cytochrom b562 106 AS 5+4 N-Methyl-p-nitro- Ku, Schultz 1995 benzylamin-BSA Tendamistat 74 AS 9 Endothelin-Ig McConell, Hoess (1995) PST1 (pancreatic 56 AS 7 o. 8 Chymotrypsin Röttgen, Collins (1995) secretory trypsin inhibitor) FN3 (fibronectin 94 AS 12 Ubiquitin Koide et al. (1998) type III domain) VH 114 AS 9 Proteine Reiter et al. (1999) Lipocalin BBP 170 AS 16 Fluorescein Beste et al. (1999) Bilin-binding protein
Scaffolds mit Peptidlibraries Immunoglobulin-like Four-helix boundle Tendamistat Cytochrome b562
a-Helix-Libraries Scaffold Größe Mut. AS Target Autor Zink-Finger 26 AS 5 Shigella flexneri Ig Choo, Klug (1995) Z-Domäne 58 AS 13 Insulin Nord et al. (1995, 1997) (Protein A) Taq-Polymerase Apo A
Zn Scaffolds mit a-Helix-Design DNA-bindendes Protein Bakterieller Rezeptor Z-Domäne vom Protein A Cys2His2- Zink-Finger
b-Faltblatt-Libraries? Scaffolds mit b-Faltblatt-Design ?
Eigenschaften des Gamma-Kristallins Strukturprotein der Augenlinse sehr stabiles Protein kleines Protein (20 kDa) kaum immunogen einfache rekombinante Herstellung 174 Aminosäuren 2 Domänen 4 b-Faltblätter mit jeweils 4 b-Strängen (greek-key)
Lösungsmittelzugänglichkeit 19 17 38 15 2 Zugänglichkeit (% der max.) 36 6 4 Aminosäurereste 1-85 (N-terminale Domäne)
Sequenz-Variabilität „Outside” „Inside”
Mutagenese im b-Faltblatt Mutagenisierte Positionen: Lys 2 Thr 4 Tyr 6 Cys 15 Glu 17 Ser 19 Arg 36 Asp 38 Arg 36 Thr 4 Tyr 6 Cys 15 Ser 19 mögliche Varianten: 208 = 2.6 E+10
Ort der Mutagenese Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2 Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%
Mutagenese-Strategie 528 bp Gamma-Kristallin 120 bp 408 bp mutagenisiertes Gamma-Kristallin XXX XXX XX
X X X X X X X X Konstruktion einer kombinatorischenGamma-Kristallin-Bank X X X • Design der Oligonukleotide • Assemblierung • Klonierung • Expression and Selektion X X X X X X
Phage Display-System X Signal- peptid Gamma-Kristallin Protein 3 Expression in der E. coli-Zelle Bildung filamentöser Phagen periplasmatisch Plasmamembran äußere Membran
Selektion auf Bindung Selektionsprozess eluierter Phage lösliches Protein
Anreicherung von Estradiol- bindenden Mutanten Polyklonaler Phagen-ELISA nach dem 3. Panning BSA BSA-Estradiol-17
BSA-Estradiol bindende Gamma-II-Kristallin-Mutanten AS-Position 2 4 6 15 17 19 36 38 WT- DNAAAG ACT TAC TGC GAG AGC CGC GAC Mu 12A AGG AAG AAA TAT AGT AAT AGG CTG Mu E6B5 TAT AGG AGG TAT AAT CAT TGG AGG Mu E6E11 AGG AAG AGT CAT GCT CAT AAT CGT WT-ProteinK T Y C E S R D Mu 12A R K K Y S N R L Mu E6B5 Y R R Y N H W R Mu E6B11 R K S H A H N R
Bindungseigenschaften der Mutante 12A Konzentrationsab- hängiger ELISA mit gereinigter Mu 12A-His Extinktion 450 nm Proteinkonzentration in µg
Bindungseigenschaften der Mutante 12A BIACORE-Unter- suchungen mit gereinigter Mu 12A-His HBS GC-WT Mu 12A
Bindungseigenschaften der Mutante 12A Bestimmung von: Ka = 3,0E +04 1/M Kd = 33 µM k on = 3,0E+03 1/Ms k off = 0,1 1/s
Stabilität der Mutante 12A Guanidin-Denaturierungskurven (20 µg/ml Protein) Mutante 12A Mutante 12A Wildtyp Wildtyp
Zusammenfassung ortsspezifische Mutagenese im Beta-Faltblatt des Gamma-II-Kristallins de novo Design von Bindungseigenschaften Erhaltung der Struktur des Proteins hohe Stabilität der Mutante rekombinante Herstellung
Gamma-Kristallin-Projekt Institut für Biotechnologie R. Rudolph Universität Halle U. Fiedler C. Reimann G. Böhm Mitarbeiter AG E. Schwarz Forschungsstelle J.- U. Rahfeld Enzymologie der Proteinfaltung K.-P. Rücknagel Max-Planck- Gesellschaft A. Schierhorn Roche GmbH M. Grohl