Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie

1. Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie Block Molekulare Arbeitstechniken Julia Knöckel

2. Gliederung • Massenspektrometrie • MALDI • Vor- und Nachteile massenspektrometrischer Analysen

3. Massenspektrometrie • Analysetechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum • seit Ende der 80er Jahre eine der wichtigsten Analysemethoden für die Protein- und Peptidanalytik • man erhält strukturelle Informationen von Proteinen ( Peptidmassen, Aminosäuresequenzen ) • ermöglicht Identifikation von Proteinen und Ermittlung von Typ und Lage von Modifikationen 3 Stufen der Analyse: 1. Probenvorbereitung: 1D- / 2D- Gelelektrophorese Extraktion eines Proteins aus dem Gel Reinigung der Probe

4. 2. Ionisierung 3.Massenanalyse Aufbau eines Massenspektrometers: Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998 Detektor Liefert Massenspektrum, aus dem abgelesen werden kann, welche Ionen in welchen relativen Mengen gebildet worden sind Ionenquelle Aus einer Substanz- probe wird ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt Massenanalysator Auftrennung der Ionen nach Masse/ Ladungs- Quotienten (m/z)

5. Ionisierung der Analytmoleküle durch Aufnahme oder Verlust eines Elektrons Trennung und Nachweis der Analytionen Mehrere Analysatoren mit entsprechend geeigneten Detektoren • Beschuss der Probe mitElektronen (Elektronenstoß- Ionisation, EI) • Beschuss mit Atomen oder Ionen ( Fast- Atom- Bombardement, FAB) • Beschuss mit Photonen (Laserdesorption/ Ionisation, LDI) • Versprühen der Probe in einem elektrischen Feld (Elektrospray- Ionisation, ESI) • Ionentrennung erfolgt • Durch Kombination eines Magnetfeldes mit einem elektrischen Feld ( Sektorinstrumente ) • Im Hochfrequenzfeld eines Quadrupol- Stabsystems (Quadrupolinstrumente) • Nach ihrer Flugzeit in einem Messrohr in Verbindung mit einer gepulsten Ionenerzeugung ( time- of- flight (TOF)- Instrumente )

6. Zur Sequenzierung von Peptiden: • zwei Stufen von MS nötig „tandem MS“ oder MS/MS • es kann das Selbe Separationsprinzip oder eine Kombination aus verschiedenen MS- Prinzipien verwendet werden

7. MALDI Matrix- unterstützte (assisted) Laserdesorptions/ Ionisations- Massenspektrometrie Eine von zwei „soft- Ionisations- Methoden“ ( neben ESI) Probensubstanz wird in eine Matrix eingebaut Matrixsubstanz muss bei der ausgewählten Laserwellenlänge absorbieren Im Gemisch: 1000- 10000facher Überschuss an Matrixsubstanz Matrixsubstanzen: kleine organische Moleküle Standardpräparation mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure oder Dihydrobenzoesäure (DHB) DHB Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998 α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

8. Vorgehen: Proben- und Matrixsubstanz werden auf einem metallischen Probenteller gemischt Lösungsmittel aus der Matrixsubstanz verdunstet Kokristallisation von Matrix und Analyt Probenmoleküle werden in das Matrix- Kristallgitter eingebaut EM-Aufnahme einer Standardpräparation von Cytochrom C in DHB- Matrix Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998 Kristall wird mit kurzen Laserpulsen beschossen ( wenige ns lang ) Normalerweise Verwendung von N- Lasern mit Wellenlänge 337 nm

9. Gegenüber der Probe: Elektrode Erzeugt ein elektrisches Feld von einigen 100- 1000 V/mm Je nach Polarität der Elektrode werden positive oder negative Ionen von der Probenoberfläche in Richtung des Analysators beschleunigt Probe ist auf einem beweglichen Tisch montiert und kann so systematisch abgefahren werden Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

10. Massenanalyse: • Flugzeit- Massenspektrometer ( Time- of- flight- Analysatoren) • Genaue Messung der Zeit, die zwischen Start der Elektronen in der Quelle bis zum Eintreffen auf dem Detektor vergeht • Kleine Ionen sind schneller als große Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998 • Da m/z ~ t², lässt sich die Masse aus der Flugzeit berechnen • Kalibrierung über Referenzsubstanzen mit bekannter Masse • Typische Flugzeiten: wenige μs bis einige 100 μs • Länge der Driftstrecken 1- 4 m

11. Problem: nicht alle Ionen einer Masse haben die gleiche Startenergie • Umlenken des Probenstrahls über einen Reflektor ( elektrisches Gegenfeld) • Ionen mit höherer Startenergie dringen weiter ins Reflektorfeld ein • der Weg wird weiter • Ausgleich der Energiedifferenz Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

12. Detektion der Ionen Erzeugung einer Elektronenkaskade in einem Sekundärelektronenvervielfacher ( SEV) analoges Signal Analoges Signal wird digitalisiert und an einen PC geleitet Analyse der Messergebnisse durch Vergleich mit Datenbanken MALDI-TOF-Spektrum des Peptids Angiotensin II • Datenbank- Typen: • Vollständige Proteinsequenzen • Expressed- sequence- tag Databases ( EST): kurze Sequenzen aus zufälliger Sequenzierung von cDNA- Bibliotheken • Genom- Datenbanken Quelle: Lottspeich: Bioanalytik, 1998

13. Vorteile Nachteile • massenspektrometrische Analysen laufen vollständig automatisiert ab • Identifikation und Quantifizierung in einem Schritt • Ermöglicht schnelle Identifikation, wenn ein vollständig decodiertes Genom verfügbar ist • Proben können direkt nach in- Gel- Verdau verwendet werden • Allgemein: hohe Sensitivität • Toleranz von Proteingemischen • angewiesen auf Datenbanken mit Daten des untersuchten Organismus

14. Danke für die Aufmerksamkeit