Bioq . Verónica Ampuero JTP Parasitología y Micología Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia.

1. Diagnóstico: Herramientas convencionales aplicadas según la etapa (métodos parasitológicos e inmunológicos). Reactivos disponibles en el medio Bioq. Verónica Ampuero JTP Parasitología y Micología Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis

2. Diagnostico de laboratorio • La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en la región, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina. • La importancia de la enfermedad radica en los daños que ocasiona a nivel del sistema nervioso, cardiovascular y digestivo.

3. Diagnostico de laboratorio • La transmisión del T. cruzial ser humano, puede producirse por distintas vías: a) vectorial por tratomíneos (vinchuca), b) congénita, (vía vertical de madre a hijo) c) por transfusiones o transplante, d) digestiva, considerada ahora como una ETA, e) vía accidental

4. Diagnostico de laboratorio • La enfermedad de Chagas presenta tres etapas clínicas: • aguda, • indeterminada • y crónica Debemos tener en cuenta el período ventana que se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo, cumple un ciclo de desarrollo en el hospedador que abarca entre 7 a 15 días, donde comienza a ser detectable.

5. Diagnostico de laboratorio Por esto es fundamental conocer tres aspectos: • Cuándo realizar un análisis • Qué análisis realizar • Cuales son los objetivos de la realización del análisis Para evitar la realización de estudios parasitológicos y/o serológicos en un momento inadecuado, con la consecuencia de posibles falsos resultados negativos.

6. Diagnostico de laboratorio ETAPA INICIAL se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias. ETAPA AGUDA el diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito

7. Diagnostico de laboratorio ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA el diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti Trypanosomacruzi.

8. Diagnostico de laboratorio En nuestro país, el diagnóstico serológico debe efectuarse por dos reacciones en paralelo, y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba a fin de definir el resultado.

9. Para lograr un diagnóstico confiable, el laboratorio debe realizar una elección adecuada de los reactivos, antes de implementar su utilización en la rutina diagnóstica diaria.

10. Diagnostico de laboratorio- toma de muestra MOMENTO DEL CONTAGIO deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas para Chagas, a los fines de conocer si el paciente tiene ya una infección previa. Si la misma es negativa la segunda muestra debe ser obtenida respetando el periodo de ventana desde el inicio de la posible infección.

11. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDA En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los MÉTODOS PARASITOLOGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la disponibilidad de recursos humanos capacitados y equipamiento en cada laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARASITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro de CERTEZA DIAGNÓSTICA.

12. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos Las metodologías actualmente recomendadas son: GOTA FRESCA GOTA GRUESA TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNOSTICO

13. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-GOTA FRESCA Aumentar irrigación gota de citrato al 2%) 100x / 400x 45 minutos Tripanosoma cruzi Sensibilidad 50%

14. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-GOTA GRUESA Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. Lavar y secar 1-2min Dejar secar Desfibrinar Colocar 1 a 3 gotas objetivo de 100x aceite Tripanosoma cruzi Sensibilidad 50%

15. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-STROUT Suero 600 rpm 2 min. 2500 rpm 10 min. 5-10 mL Coag. Sedimento Tº amb Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Sensibilidad 95%

16. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-MICROHEMATOCRITO BIOSEGURIDAD Cerrar extremo con plastilina Cortar • 45 segundos a 5000 rpm • 6 a 9 microhematocritoheparinizado Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Sensibilidad 90 a 95%

17. La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE • Puede brindar falsos resultados negativos: • si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados • Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero. • Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una • adecuada adherencia y dificulta la observación. • Por razones de Bioseguridad del operador: Esto es crucial, ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.

18. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-hemocultivo • Hemocultivo: consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

19. El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura. Existen técnicas estandarizadas con sangre heparinizada, recogida en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre) que se realizan en un centro de referencia de la pcia. De Córdoba.

20. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-xenodiagnóstico • Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica. • Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos, luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.

21. Diagnostico de laboratorio- ETAPA AGUDAmetodosparasitologicos-xenodiagnóstico • Xenodiagnostico: consiste en amplificar el nº de parásitos utilizando al vector.

22. Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico

23. En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O MICROSTROUT y HEMOCULTIVO empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos durante el período agudo.

24. Etapa cronica- metodos serológicos

25. El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de probabilidad.

26. Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS RESULTADOS.

27. Métodos serológicos : Los métodos actualmente validados son: • ELISA • Hemaglutinación indirecta (HAI) • Inmunofluorescencia (IF)

28. Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP) S: capacidad de un método de dar resultado positivo en presencia de infección E: capacidad de un método de dar resultado negativo en ausencia de infección VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-). Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor).

29. Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Tripanosoma cruzi Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos serológicos diferentes: ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF

30. Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad. Permite procesar elevado número de muestras y, además, es la que mejores resultados permite obtener en muestras de sangre entera (sangre con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos biológicos como el trasudado mucoso oral.

31. La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras.

32. La técnica de IF sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.

33. EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL.

34. Kits comerciales

35. Kits comerciales

36. Gracias por la atención, nos vemos en el practico!